Bakteri - Materi Lengkap Tentang Bakteri

Pengertian Bakteri

Bakteri dilihat dengan mikroskop elektron

Bakteri berasal dari bahasa Latin bacterium; jamak: bacteria adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik). Hal ini menyebabkan organisme ini sangat sulit untuk dideteksi, terutama sebelum ditemukannya mikroskop. Barulah setelah abad ke-19 (setelah ditemukannya mikroskop), ilmu tentang mikroorganisme terutama bakteri (bakteriologi) mulai berkembang.

Ciri Ciri Morfologi Bakteri

Morfologi bakteri sangat sederhana, sehingga sangat tidak mungkin hanya menggunakan morfologi sel untuk informasi taksonomi. Namun demikian morfologi tetap bernilai dalam taksonomi. Morfologi bakteri yang dipertimbangkan adalah :

A. Bentuk sel bakteri

Pada umumnya bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar (berdasarkan bentuknya) yaitu:

1. Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:

- Mikrococcus, jika kecil dan tunggal
- Diplococcus, jka berganda dua-dua
- Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujur sangkar
- Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus
- Staphylococcus, jika bergerombol
- Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai

2. Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut:

- Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua
- Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai

3. Spiral (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut:

- Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran (bentuk koma)
- Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran
- Spirochete, jika lengkung membentuk struktur yang fleksibel.

B. Ukuran sel bakteri

- Sangat kecil dan bervariasi : 1,0 - 5,0 x 0,5 - 1,0 μm, diameter 0,6 - 3,5 μm
- Diamati dengan mikroskop pada pembesaran maksimum (100 X)
- Detil struktur sel dapat diamati dengan menggunakan mikroskop elektron

Struktur Sel bakteri

Struktur Sel bakteri dapat dibagi atas 3 bagian utama yaitu :
1. Dinding sel
2. Bagian internal berupa protoplasma yang mengandung :
• Membran sel
• Inclusion body
• Mesosom
• Ribosom
• Nukleoid (DNA)
3. Bagian eksternal
• Kapsul
• Flagela
• Pili

Dinding sel

Dinding sel bakteri sangat tipis dan elastis ,terbentuk dari peptidoglikan yang merupakan polimer unik yang hanya dimiliki oleh golongan bakteri. Fungsinya dinding sel adalah- memberi bentuk sel, member perlindungan dari lingkungan luar dan mengatur pertukaran zat-zat dari dan ke dalam sel Teknik pewarnaan Gram adalah untuk menunjukan perbedaan yang mendasar dalam organisasi struktur dinding sel bakteri atau cell anvelope.
Bakteri Gram positif memiliki dinding sel relatif tebal, terdiri dari berlapis-lapis polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel menahan lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika dicuci dengan alkohol atau aseton. Bakteri Gram negatif memiliki dinding sel berupa lapisan tipis peptidoglycan, yang diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri dari lipopolysaccharide (LPS). Daerah antara peptidoglycan dan lapisan LPS disebut periplasmic space (hanya ditemui pada Gram negatif) adalah zona berisi cairan atau gel yang mengandung berbagai enzymes dan nutrient-carrier proteins. Kompleks Crystal violet-iodine mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis peptidoglycan ketika sel diperlakukan dengan pelarut. Ketika sel diberi perlakuan pewarna tandingan Safranin O, pewarna tersebut dapat diserap oleh dinding sel bakteri Gram negatif.

Protoplasma

Yaitu semua material yang terdapat didalam dinding sel.

A. Membran sel : Terdapat dibagian dalam dinding sel, terdiri dari phospholipid yang tersusun bilayer , dan mengandung berbagai protein yaitu:
– Enzym untuk reaksi
– Pori untuk proses difusi
– Reseptor untuk transpor
– Reseptors untuk mengenal, komunikasi, dan penempelan.
B. Sitoplasma : Merupakan cairan sel yang terdapat didalam plasma membran. Terdiri dari 80% air, ribosom, berbagai enzim, koenzim, senyawa organik (protein, lemak, karbohidrat, dll), senyawa anorganik.
C. Ribosom : organel sel yang berfungsi sebagai pabrik protein
D. Mesosome : Invaginasi dari plasma membran, dalam bentuk vesikel, tubule, atau lamela
E. Nukleoid : Material genetik bakteri/kromosom bakteri/DNA , berbentuk circular (melingkar), membawa sifat yg mengatur viabilitas bakteri.
F. Plasmid : Material genetik non esensial, ekstra kromosom, berbentuk melingkar tetapi ukuran lebih kecil dari DNA, membawa sifat-sifat tambahan ketahanan terhadap antibiotik, ultra violet, patogenisitas, produksi bakteriosin, dll, tetapi tidak membawa sifat untuk viabilitas sel. Plasmid dapat berpindah antar bakteri, atau dari bakteri ke sel tanaman inang (contoh pada Agrobakterium tumefaciens).

Bagian eksternal

A. Flagela
Berfungsi sebagai alat gerak, struktur utamanya adalah protein yang disebut flagellin, fleksibel, ukuran diameter10-15μm, dengan panjang 10-20μm. Berdasarkan tempat dan jumlah flagel yang dimiliki, bakteri dibagi menjadi lima golongan, yaitu:

-Atrik, tidak mempunyai flagel.
-Monotrik, mempunyai satu flagel pada salah satu ujungnya.
-Lofotrik, mempunyai sejumlah flagel pada salah satu ujungnya.
-Amfitrik, mempunyai satu flagel pada kedua ujungnya.
-Peritrik, mempunyai flagel pada seluruh permukaan tubuhnya.
B. Pili/Fimbriae
Merupakan alat untuk menempel pada permukaan (adhesin) substrat. Pili ada yang khusus digunakan untuk konjugasi, disebut pili sex. DNA bakteri dapat ditransfer dari satu sel bakteri ke sel bakteri lain selama proses konjugasi.
C. Kapsul/envelope
Merupakan selubung sel bakteri berupa extracellularpolysacharide (EPS). Berupa kapsul bila melekat erat pada dinding sel atau berupa lendir dengan struktur longgar Berfungsi sebagai pelindung sel dari kekeringan dan serangan mikroorganisme lain; alat untuk melekat pada permukaan; berperan dalam penyerapan ion selektif; dan dalam interaksi inang-patogen.

Reproduksi Bakteri

Bakteri umumnya melakukan reproduksi atau berkembang biak secara aseksual (vegetatif = tak kawin) dengan membelah diri. Pembelahan sel pada bakteri adalah pembelahan biner yaitu setiap sel membelah menjadi dua. Selama proses pembelahan, material genetik juga menduplikasi diri dan membelah menjadi dua, dan mendistribusikan dirinya sendiri pada dua sel baru. Bakteri membelah diri dalam waktu yang sangat singkat.Pada kondisi yang menguntungkan berduplikasi setiap 20 menit.

Cara Reproduksi Bakteri selain pembelahan biner antara lain :
1. Konjugasi : reproduksi seksual dimana bakteri bertukar bahan genetik sebelum membelah diri, sehingga turunannya memiliki gen baru. Material genetik ditransfer melalui pili sex.
2. Transformasi – bakteri mengambil gen dari bakteri lain yang telah mati dari lingkungannya.
3. Transduksi – virus menyisipkan gen baru ke dalam sel bakteri. Metoda ini digunakan dalam bioteknologi untuk menghasilkan bakteri yang dapat menghasilkan insulin.

Klasifikasi Bakteri

Klasifikasi adalah meletakkan organisme kedalam kelompok taksonomik berdasarkan persamaan karakter yang dimiliki. Klasifikasi Bakteri Patogen Tanaman mengikuti Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition (1994) :
KINGDOM PROKARIOT
BAKTERI – Memiliki membran dan dinding sel

Devisi I : GRACCILICUTES – Bakteri Gram negatif
Klas : PROTEOBACTERIA – Umumnya bersel tunggal
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Erwinia

Famili : Pseudomonadaceae
Genus : Acidovorax, Pseudomonas, Rhizobacter, Xanthomonas, Xylophilus

Famili : Rhizobiaceae
Genus : Agrobacterium, Rhizobium

Famili : -
Genus : Xylella

Devisi II : FIRMICUTES – Bakteri Gram Positif
Klas : FIRMIBACTERIA – Umumnya bersel tunggal
Genus : Bacillus, Clostridium

Klas : THALLOBACTERIA – bakteri bercabang
Genus : Arthrobacter, Clavibacter, Curtobacterium,
Rhodococcus, Streptomyces

Devisi III: TENERICUTES
Klas : Mollicutes
Famili : Spiroplasmataceae
Genus : Spiroplasma

Famili : -
Genus : belum ditetapkan, dikenal sebagai phytoplasma (dulu disebut micoplasmalike organisms (MLO)

Devisi IV: MENDISICUTE
Klas : Archaeobacteria

Jenis-jenis Bakteri

Berdasarkan cara memperoleh makanannya, bakteri dapat digolongkan menjadi dua golongan yaitu bakteri heterotrof dan bakteri autotrof.

A. Bakteri Heterotrof 

Bakteri ini hidup dengan memperoleh makanan berupa zat organik dari lingkungannya karena tidak dapat menyusun sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa-sisa organisme lain. Bakteri yang mendapatkan zat organik dari sampah, kotoran, bangkai dan juga sisa makanan, kita sebut sebagai bakteri saprofit. Bakteri ini menguraikan zat organik dalam makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O, energi dan mineral.

B. Bakteri Autotrof 

Bakteri Autotrof adalah bakteri yang dapat menyusun zat makanan sendiri dari zat anorganik yang ada. Dari sumber energi yang digunakannya, bakteri autotrof (auto = sendiri, trophein = makanan) dibedakan menjadi dua golongan, yaitu:
1. Bakteri fotoautrotof
Bakteri fotoautrotof yaitu bakteri yang memanfaatkan cahaya sebagai energi untuk mengubah zat anorganik menjadi zat organik melalui proses fotosintesis. Contoh bakteri ini adalah: bakteri hijau, bakteri ungu.
2. Bakteri kemoautrotof
Bakteri kemoautrotof adalah bakteri yang menggunakan energi kimia yang diperolehnya pada saat terjadi perombakan zat kimia dari molekul yang kompleks menjadi molekul yang sederhana dengan melepaskan hidrogen. Contoh bakteri ini adalah: Nitrosomonas. Nitrosomonas dapat memecah NH3 menjadi NH2, air dan energi.

Di samping terdapat bakteri yang dikelompokkan berdasarkan cara mendapatkan makanan, ada juga penggolongan bakteri berdasarkan sumber oksigen yang diperlukan dalam proses respirasi. Bakteri itu dikelompokan sebagai berikut:
1. Bakteri aerob
yaitu bakteri yang menggunakan oksigen bebas dalam proses respirasinya. Misal: Nitrosococcus, Nitrosomonas dan Nitrobacter.
2. Bakteri anaerob
yaitu bakteri yang tidak menggunakan oksigen bebas dalam proses respirasinya. Misal: Streptococcus lactis.

Sedangkan berdasarkan kebutuhan terhadap oksigen, bakteri dikelompokkan lagi menjadi:
1. Bakteri aerob obligat
yaitu bakteri yang hanya dapat hidup dalam suasana mengandung oksigen. Misal: Nitrobacter dan Hydrogenomonas.
2. Bakteri anaerob obligat
yaitu bakteri yang hanya dapat hidup dalam suasana tanpa oksigen. Misal: Clostridium tetani.
3. Bakteri anaerob fakulatif
yaitu bakteri yang dapat hidup dengan atau tanpa oksigen. Misal: Escherichia coli, Salmonella thypose dan Shigella.

Media selektif dan diferensial

Media selektif dan diferensial digunakan untuk mengisolasi atau mengidentifikasi organisme tertentu.

Media selektif memungkinkan beberapa jenis organisme untuk tumbuh, dan menghambat pertumbuhan organisme lain. Selektivitas dicapai dengan beberapa cara. Sebagai contoh, organisme yang memanfaatkan gula sebagai satu-satunya sumber karbon dapat dipisahkan dengan menambahkan gula dalam medium. Di sisi lain, penghambatan selektif beberapa jenis mikroorganisme dapat dicapai dengan menambahkan zat pewarna, antibiotik, garam atau inhibitor spesifik yang mempengaruhi metabolisme atau sistem-sistem enzim organisme. Misalnya, media yang mengandung potassium tellurite, natrium azida atau thallium asetat (pada konsentrasi 0,1-0,5 g / l) akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram-negatif. Media dilengkapi dengan penisilin (5-50 unit / ml) atau violet kristal (2 mg / l) akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif. Selain itu Tellurite agar digunakan untuk mengidentifikasi organisme Gram-positif.

Media Diferensial digunakan untuk membedakan organisme atau kelompok organisme yang terkait erat. Karena adanya zat pewarna atau bahan kimia tertentu di media, organisme akan menghasilkan perubahan karakteristik atau pola pertumbuhan yang digunakan untuk identifikasi atau diferensiasi.

Derikut Beberapa Media selektif dan diferensial yang Umum digunakan:

Mannitol salt agar

mannitol salt agar atau disingkat MSA (agar garam manitol )merupakan media selektif dan diferensial untuk identifikasi staphylococcus aureus. Media ini mengandunng garam natrium klorida 7,5% sehingga media ini menjadi media selektif. Karena sebagian besar bakteri tidak dapat tumbuh pada konsenterasi garam7,5% kecuali staphylococcus . Selain itu MSA mengandung manitol dan indikator PH phenol red yang membuat media ini menjadi media diferensial. Staphylococcus Aureus akan menghasilkan koloni kuning dengan zona kuning karena dapat memfermentasi manitol menjadi asam yang kemudian merubah warna indikator phenol red dari merah menjadi kuning, sedangkan Staphylococcus jenis lainnya menghasilkan koloni merah muda kecil atau koloni merah dengan tidak ada perubahan warna medium karena tidak dapat memfermentasi manitol.

Eosin metilen biru agar

Eosin metilen biru agar merupakan media diferensial digunakan untuk deteksi dan isolasi patogen Gram-negatif usus (fecal bacteria). Kombinasi eosin dan metilen biru yang digunakan sebagai indikator dan memungkinkan diferensiasi antara organisme yang memfermentasi laktosa dan yang tidak memfermentasi laktosa. Sukrosa juga termasuk didalam medium ini karena anggota tertentu dari Enterobacteria atau kelompok coliform lebih mudah memfermentasi sukrosa daripada memfermentasi laktosa. Selain itu metilen biru bertindak sebagai inhibitor untuk organisme Gram-positif.

Bakteri E coli merupakan Fermentor kuat laktosa sehingga menghasilkan koloni ungu gelap dengan kemilau hijau metalik, hal ini disebabkan besarnya kuantitas asam (yang dihasilkan dari fermentasi) sehingga mengendapan zat pewarna di atas permukaan agar.
Bakteri coliform lain seperti Enterobacter aerogenes memfermentasi laktosa lebih lambat sehingga hanya menghasilkan koloni merah muda ke unguan.
Bakteri non-fermentasi menghasilkan koloni tanpa warna atau terlihat trnasparan.

MacCONKEY'S AGAR

MacConkey agar adalah medium kultur yang dirancang untuk menumbuhkan bakteri Gram-negatif dan membedakan mereka berdasarkan kemampuan memfermentasi laktosa.
Media ini berisi garam empedu (untuk menghambat sebagian besar bakteri Gram-positif), pewarna kristal violet (yang juga menghambat bakteri Gram-positif tertentu), pewarna neutral red (sebagai PH indikator untuk mengetahui adanya fermentasi laktosa), laktosa dan pepton.

Pada dasarnya bakteri enterik dipisahkan ke dalam dua kelompok:
a). Coliform basil menghasilkan asam dari fermentasi laktosa danEscherichia coli menghasilkan kuantitas asam lebih banyak dibandingkan spesies coliform yang lain. hal ini menjadikan medium di sekitar pertumbuhan juga akan berubah menjadi merah. Selain itu pengaruh asam juga menyebabkan terjadinya pengendapan garam empedu yang diikuti penyerapan pewarna neutral red. Sehingga Koloni bakteri akan berwarna merah pada permukaannya.
b). Disentri, tifoid, dan paratifoid batang tidak memfermentasi laktosa, maka tidak menghasilkan asam. Maka Koloni akan terlihat tidak berwarna atau transparan.

Blood Agar Plate Dan Uji Hemolisi

Hemolisis (atau haemolysis dalam bahasa Inggris) adalah kerusakan sel darah merah. Dalam dunia mikrobiologi hemolisis digunakan untuk mengklasifikasikan mikroorganisme tertentu, dengan cara mengamati Kemampuan koloni bakteri untuk menginduksi hemolisis bila ditanam pada agar darah (blod agar). Cara tersebut sangat berguna dalam mengklasifikasikan spesies streptokokus. Sebuah zat yang menyebabkan hemolisis adalah hemolisin.

Blod agar atau agar darah biasanya dibuat dari Tryptic Soy Agar atau Columbia Agar base dengan darah domba 5%. atau bisajuga darah Kelinci atau kuda dapat digunakan untuk pertumbuhan organisme yang membutuhkan NAD, seperti spesies Haemophilus. Pengunaan darah manusia tidak disarankan karena kemungkinan paparan patogen melalui darah manusia seperti HIV atau hepatitis.

Interpretasi dari Hemolisis pada Blod agar plate

Untuk membaca reaksi hemolitik pada lempeng Blod agar (agar darah), petri harus mengangkat ke sumber cahaya dan diamati dengan cahaya yang datang dari belakang (cahaya yang ditransmisikan).

Ada 3 jenis hemolisis yaitu beta hemolisis (β), alpha hemolisis (α), dan gamma hemolisis (γ)

Beta hemolisis (β) atau biasa disebut hemolisis total, didefinisikan sebagai lisis seluruh sel darah merah. Sebuah zona yang jelas, mendekati warna dan transparansi media dasar, mengelilingi koloni.

Banyak spesies bakteri menghasilkan toksin atau racun yang mampu menghancurkan sel-sel darah merah. Beberapa spesies menghasilkan beberapa racun atau menampilkan berbagai tingkat beta hemolisis. Salah satu contoh adalah strain sesekali Streptococcus pyogenes yang hanya menghasilkan hemolisin yang labil oksigen (anaerob fakultatif) yang disebut "streptolysin O". Dengan kata lain, hemolisin hanya aktif dalam kondisi oksigen rendah. Hemolisis dapat ditunjukkan dengan teknik pour plate atau teknik overlay agar, atau inkubasi dalam lingkungan anaerobik. Salahsatu cara sederhana dan mudah untuk menghasilkan kondisi anaerob pada plate agar adalah "menusuk" loop inokulasi secara vertikal ke dalam agar setelah mengores.

(Kebanyakan strain Streptococcus pyogenes juga memproduksi oksigen stabil hemolisin "streptolisin S" yang menghasilkan lisis di udara ambien).
Contoh lain ditemukan dalam Streptococcus agalactiae dan Listeria monocytogenes. Untuk spesies ini, hemolisin mungkin sangat lambat diproduksi atau lemah reaktif. Terlihat hemolisis mungkin begitu halus bahwa itu hanya terlihat langsung di bawah koloni (bukan secara luas menyebar seperti pada S. pyogenes, di atas). Untuk membuktikan dan memvisualisasikan reaksi yang sangat lemah ini, koloni dapat dihapus dengan loop inokulasi, yang memungkinkan kita untuk melihat sel-sel lisis tepat di bawah di mana koloni telah berkembang.

Alpha hemolisis (α) disebut juga hemolisis sebagian, adalah penurunan hemoglobin sel darah merah untuk methemoglobin dalam medium sekitar koloni. Hal ini menyebabkan perubahan warna hijau atau coklat dalam medium. Warna dapat disamakan dengan "memar" sel. Pemeriksaan mikroskopis sel darah merah alpha-hemolyzed menunjukkan bahwa membran sel yang utuh, sehingga tidak, pada kenyataannya, lisis benar.

Beberapa penulis buku teks mengacu pada alpha sebagai "hemolisis parsial," yang mungkin membingungkan kepada peneliti. Hal yang paling penting agar tidak membingungkan hemolisis "parsial" atau "tidak sempurna" ini berbeda dengan hemolisis "lemah" atau "halus" seperti Streptococcus agalactiae atau Listeria monocytogenes yang terlihat di atas. Warna coklat atau hijau Beta hemolisis tidak akan meliputi atau menutupi sel-sel didalam medium sekitarnya. Pada inkubasi berkepanjangan, banyak organisme alpha hemolitik akan mulai muncul lebih jelas, tetapi jika media sekitarnya mengandunga atau tertutup salah satu warna coklat atau hijau "hemolisis" maka masih dianggap alpha hemolisis.

Gamma hemolisis (γ) disebut juga non hemolisis. Gamma menunjukkan kurangnya hemolisis. Seharusnya tidak ada reaksi dalam medium sekitarnya. "Gamma Streptococcus" atau Enterococcus faecalis (pada inkubasi 24 jam, non-hemolitik). "Gamma streptococcus" biasanya non-hemolitik setelah 24 jam inkubasi, namun banyak yang akhirnya menampilkan hemolisis alpha lemah.

Sumber http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2885-blood-agar-plates-and-hemolysis-protocols

ALOA Media Selektif Untuk Listeria

Jika kita melakukan analisa listeria monocytogenes dengan mengacu kepada metode ISO ISO 11290-1 Amd.1: 2004 maka media ALOA wajib digunaka. ALOA merupakan media selektif dan diferensial untuk isolasi Listeria spp, dari sampel makanan dan untuk identifikasi dugaan L. monocytogenes.

Media ALOA mengandung lithium klorida serta antimikroba dan antijamur yang digabungkan secara seimbang, yang berfungsi untuk meminimalkan pertumbuhan organisme pengganggu. ALOA mengandung substrat chromogenic X-glucoside (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyrano) yang berfungsi untuk mendeteksi adanya beta-glucosidase yang terdapat pada Listeria spp. Selain itu ALOA juga mengandung substrat ( L - α - fosphatidylinositol ) yang berfungsi untuk mendeteksi enzim phosphatidylinositol phospholipase C (PI-PLC) yang dihasilkan L. monocytogenes dan beberapa strain L.ivanovii . Denagn adanya kombinasi dari kedua substrat tersebut , kita dapat membedakan antara koloni Listeria spp dengan koloni L.monocytogenes . Koloni Listeria spp tumbuh dengan warna hijau - biru , sedangkan koloni L.monocytogenes tumbuh dengan warna hijau - biru dikelilingi oleh halo opak.

koloni L.monocytogenes pada ALOA

Koloni L.ivanovii pada ALOA

Berdasarkan Penelitian recovery Listeria spp selain strain L. monocytogenes pada media ALOA setara dengan media Oxford dan PALCAM untuk L. innocua dan L. welshimeri. sedangkan untuk recovery L. ivanovii, L. seeligeri dan L. grayi pada ALOA berkurang jika dibandingkan dengan media Oxford Agar . Sdangkan pada media PALCAM Agar didapatkan yang paling penghambat terhadap 3 spesies ini (L. ivanovii, L. seeligeri dan L. grayi).

Semua Listeria spp diteliti menghasilkan koloni khas berwarna hijau - biru dengan diameter 1.0 - 2.0mm setelah inkubasi 24 jam pada suhu 37⁰C, dengan semua strain L. monocytogenes menghasilkan halo buram khas. Strain L. ivanovii juga menunjukkan halo yang intensif dengan inkubasi lebih lanjut. Strain non Listeria diteliti, hanya beberapa strain Bacillus cereus, dan Enterococcus faecium dapat tumbuh pada ALOA.

Kesimpulan

• Media ALOA merupakan media selektif untuk listeria spp
• Koloni listeria spp pada ALOA berwarna hijau-biru
• koloni L.monocytogenes dan L. ivanovii pada ALOA berwarna hijau – biru dengan halo buram khas
• Waktu inkubasi 24 jam pada suhu 37⁰C, jika koloni yang tumbuh sedikit/kurang (tidak ada koloni yang tumbuh) maka di inkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37⁰C
• • Strain Bacillus cereus, dan Enterococcus faecium juga dapat tumbuh pada media ALOA

Sumber Stres dan Kerusakan Sublethal pada Bakteri

Sangatlah penting bagi kita sebagai analis mikrobiologi mengetahui penyebab atau sumber Stres dan kerusakan sublethal pada bakteri, agar kita mengetahui penanganan/handling sample secara tepat. Agar tidak terjadi kesalahan false negative, yaitu kita melaporkan hasil analisa yang seharusnya positif tapi hasil analisa kita negatif. Akibat dari handling sample yang tidak tepat menyebabkan bakteri dalam sample menjadi stres atau mengalami kerusakan sublethal.

Kerusakan pada Bakteri dapat didefinisikan secara sederhana sebagai efek dari satu atau lebih perlakuan subletal pada mikroorganisme. Dengan katalain, kerusakan subletal merupakan konsekuensi dari paparan proses kimia atau fisik yang merusak tetapi tidak membunuh mikroorganisme. Istilah “stres” telah digunakan untuk menjelaskan akibat dari Perlakuan subletal. Namun, beberapa peneliti menganggap istilah “kerusakan/cedera” lebih disukai, karena pada organisme yang kompleks deskripsi kerusakan menggambarkan "kerusakan fisik yang bersifat sementara dan dapat dipulihkan" sedangkan, istilah stres membawa arti yang lebih halus, yakni “belum tentu menyebabkan kerusakan fisik tetapi hanya mengubah perilaku organisme”. Literatur saat ini yang berkaitan dengan kerusakan mikroba biasanya tidak mempermasalahkan perbedaan ini, dan istilah yang sering digunakan secara bergantian.

perlakuan fisik dan kimia yang dapat menyebabkan mikroorganisme rusak/cedera

Fisik
Pengeringan, termasuk udara, vakum, dan pengeringan beku
Panas, khususnya proses pemanasan subletal
Tekanan hidrostatik tinggi
Suhu rendah, termasuk pendinginan dan pembekuan
Radiasi: gamma, UV. dan X ray
Padatan: konsentrasi gula. garam

Kimia
Pembersih kimia: klorin, yodium. senyawa surfaktan
Perlakuan oksidatif, termasuk ozon.
H2O,, sistem laktoperoksidase
pH: alkali dan asam (organik dan anorganik)
Pengawet: sorbat. benzoat, nitrat. bakteriosin, dll

SUMBER STRES BAKTERI

Asam dan alkalin stres. Kejutan asam akut atau stres asam secara bertahap dapat terjadi dalam kondisi pH rendah ketika ion H melintasi membran sel bakteri dan menciptakan pH intraseluler asam. Stres asam dapat terjadi pada saat fermentasi makanan atau dengan penambahan bahan pengawet seperti asam organik. Demikian juga, stres alkali dapat terjadi dalam kondisi pH meningkat. Banyak deterjen dan pembersih kimia, seperti caustic soda (NaOH) dan senyawa amonium, yang digunakan untuk membersihkan fasilitas pengolahan makanan dan permukaan kontak makanan.

Stres karena kelaparan. Stres karena kelaparan dapat terjadi pada bangkai hewan, dalam makanan, pada permukaan peralatan. dinding, lantai, dan di air. Dickson dan Frank mendefinisikan stres karena kelaparan sebagai kelangsungan hidup bakteri dalam lingkungan oligotrophic, yaitu lingkungan dengan konsentrasi oksigen yang cukup tetapi nutrisi yang tersedia rendah atau tidak ada untuk mendukung kegiatan metabolisme biokimia dan perbanyakan.

Stres dingin. Salmonella dilaporkan dapat bertahan selama penyimpanan pada suhu 5 ° C hingga 8 bulan. Fenomena Kejutan dingin terjadi ketika bakteri tumbuh terkena penurunan suhu tiba-tiba setidaknya 10 ° C, yang menyebabkan Kejutan dingin pada mikroorganisme yang rentan. Selain itu, cidera akibat Kejutan dingin dapat terjadi jika pengenceran serial mikroorganisme diadakan dalam lemari es ketika tes laboratorium tidak dapat segera diselesaikan. Sensitivitas bakteri pada suhu rendah sangat bervariasi dan didasarkan pada kepadatan populasi, suhu pertumbuhan, laju pendinginan, dan kisaran suhu dimana pendinginan terjadi.

kerusakan pemBekuan. Meskipun dalam bakteri, pembekuan umumnya diakui sebagai strategi efektif untuk inaktivasi mikroba. kerusakan pembekuan akibat dari paparan terus larutan terkonsentrasi dan kerusakan fisik yang disebabkan oleh pembentukan kristal es. Banyak unsur makanan dan media kultur menjadi pelindung terhadap kerusakan pembekuan, salahsatunya Krioprotektan yang berisi gliserol, sodium glutamat, gula tertentu, peptida, dan protein. Pemanfaatan krioprotektan dalam satu studi telah berkontribusi untuk meminimalkan dampak kerusakan pembekuan Escherichia coli.

Stres osmotik. Stres osmotik yang berhubungan dengan pembekuan juga terjadi selama pengeringan beku, dan ketika mikroorganisme dikenakan pembekuan, pengeringan, penyimpanan, dan rehidrasi. stres osmotik dapat terjadi ketika pergeseran osmolaritas eksternal menyebabkan air mengalir juga ke dalam atau keluar dari sel bakteri dan dalam kondisi ekstrim menyebabkan kerusakan fisik sel. Perubahan yang lebih ringan dalam osmolaritas ditandai dengan adanya garam NaCl atau lainnya atau zat terlarut yang mempengaruhi ketersediaan air bebas pada sel.

Heat shock (shock terkena panas). Berbeda dengan stres bakteri lainnya, shock terkena panas mungkin yang paling bisa dipelajari dan dipahami. Heat shock terjadi ketika organisme terkena suhu di atas kisaran pertumbuhan normal mereka. Respon heat shock telah dilaporkan terjadi pada suhu serendah 42 ° C untuk E. coli 46 ° C untuk Campylobacter jejuni, 48 ° C untuk Salmonella Typhimurium, dan 45-48 ° C untuk Listeria monocytogenes.


Jadi sangatlah penting dalam Pemilihan dan penggunaan media enrichment dan resusitasi mikrobiologi untuk ketepatan hasil pemerikasaan laboratorium dan pemulihan sel-sel yang terluka. Kesesuaian media untuk pemulihan sel terluka juga penting terkait dengan adanya oksigen reaktif intermediet pada media agar pemulihan(recovery) atau media kaldu, yang diketahui mengandung sampai dengan 10 ɥM dari H202 yang dihasilkan oleh oksidasi gula pada suhu tinggi saat sterilisasi.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 6)

8. Penanganan dan identifikasi sampel

8.1 Laboratorium harus memiliki prosedur yang mencakup pengiriman dan penerimaan sampel dan identifikasi sampel. Jika kuantitas sampel tidak memadai atau sampel dalam kondisi yang buruk karena kerusakan fisik, suhu yang salah, kemasan robek atau pelabelan kurang, laboratorium harus berkonsultasi dengan klien sebelum memutuskan apakah akan menguji atau menolak sampel.
8.2 Laboratorium harus merekam semua informasi yang relevan, misalnya
- tanggal yang relevan, dan waktu penerimaan;
- Kondisi sampel pada penerimaan dan, bila perlu suhu, dan
- Karakteristik pelaksanaan sampling (termasuk tingkat sampling dan kondisi sampel).
8.3 Sampel menunggu pengujian harus disimpan dalam kondisi yang sesuai untuk meminimalkan perubahan apapun terhadap populasi mikroba pada sample. Kondisi penyimpanan harus divalidasi, didefinisikan dan dicatat.
8.4 kemasan dan label sampel dapat sangat terkontaminasi sehingga harus ditangani dan disimpan dengan hati-hati untuk menghindari penyebaran kontaminasi. Proses desinfeksi diterapkan pada wadah luar seharusnya tidak mempengaruhi integritas sampel. Perlu dicatat bahwa alkohol tidak bersifat sporicidal(menghancurkan spora).
8,5 Subsampling oleh laboratorium segera sebelum pengujian mungkin diperlukan sebagai bagian dari metode pengujian. Mungkin tepat bahwa itu dilakukan sesuai dengan standar nasional atau internasional, yang ada, atau dengan in-house methods yang telah divalidasi. Prosedur Subsampling harus dirancang untuk mengumpulkan sampel yang representatif.
8.6 Harus ada prosedur tertulis untuk penyimpanan dan pembuangan sampel. Jika integritas sampel dapat dipertahankan mungkin tepat bahwa sampel yang disimpan sampai hasil tes diperoleh, atau lebih lama jika diperlukan. Porsi sampel laboratorium yang diketahui terkontaminasi harus didekontaminasi(destruksi) sebelum dibuang.

9. Pembuangan limbah terkontaminasi

9.1 Prosedur untuk pembuangan bahan yang terkontaminasi harus dirancang untuk meminimalkan kemungkinan mencemari lingkungan pengujian atau bahan. Ini adalah masalah manajemen laboratorium yang baik dan harus sesuai dengan standar nasional / internasional lingkungan atau kesehatan dan peraturan keselamatan.

10. Jaminan kualitas hasil dan kontrol kualitas kinerja

10.1 kontrol kualitas internal
10.1.1 Laboratorium harus memiliki sistem penjaminan mutu internal atau kontrol kualitas (misalnya penyimpangan penanganan, penggunaan sampel spiked, replikasi pengujian dan partisipasi dalam uji profisiensi, mana yang sesuai) untuk menjamin konsistensi hasil dari hari ke hari dan kesesuaian dengan kriteria yang ditetapkan.

11. prosedur pengujian

11.1 Pengujian sebaiknya dapat dilakukan menurut prosedur yang dijelaskan dalam Standar nasional, regional dan internasional.
11.2 prosedur pengujian alternatif dapat digunakan jika mereka sudah divalidasi dan setara dengan metode resmi/standar.

12. laporan pengujian

12.1 Jika hasil enumerasi adalah negatif, hal itu harus dilaporkan sebagai "tidak terdeteksi untuk unit didefinisikan" atau "kurang dari batas deteksi untuk unit didefinisikan". Hasilnya tidak harus diberikan sebagai "nol untuk unit didefinisikan" kecuali itu adalah persyaratan peraturan. Hasil uji kualitatif harus dilaporkan sebagai "terdeteksi / tidak terdeteksi dalam jumlah atau volume yang ditetapkan". Mereka juga dapat dinyatakan sebagai "kurang dari jumlah tertentu dari organisme untuk unit didefinisikan" di mana jumlah tertentu dari organisme melebihi batas deteksi metode dan ini telah disepakati dengan klien. Dalam data mentah hasilnya tidak harus diberikan sebagai nol untuk unit didefinisikan kecuali itu adalah persyaratan peraturan. Sebuah nilai yang dilaporkan "0" dapat digunakan untuk entri data dan perhitungan atau analisis kecenderungan dalam database elektronik.
12.2 Apabila estimasi ketidakpastian hasil tes dinyatakan pada laporan pengujian, batasan (terutama jika estimasi tidak termasuk komponen disumbangkan oleh distribusi mikroorganisme dalam sampel) harus dibuat jelas kepada klien.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 5)

6. Bahan acuan dan kultur acuan

6.1 Standar internasional

6.1.1 Bahan acuan dan bahan acuan bersertifikat umumnya
digunakan di laboratorium mikrobiologi untuk memenuhi syarat, verifikasi dan kalibrasi peralatan. Bila mungkin bahan-bahan referensi harus digunakan dalam matriks yang sesuai.

6.2 kultur Acuan

6.2.1 kultur Acuan yang diperlukan untuk menetapkan kinerja yang bisa diterima media (termasuk alat tes), untuk memvalidasi metode, untuk memverifikasi kesesuaian metode pengujian dan untuk menilai atau mengevaluasi kinerja yang sedang berlangsung. Ketertelusuran diperlukan, misalnya, saat membuat performa media test kit dan metode validasi. Untuk menunjukkan ketertelusuran, laboratorium harus menggunakan strain mikroorganisme acuan yang diperoleh langsung dari koleksi nasional atau internasional yang diakui, bila ada. Atau, turunan komersial yang semua sifat yang relevan telah ditunjukkan oleh laboratorium untuk menjadi setara pada titik penggunaan dapat digunakan.
6.2.2 strain Acuan dapat disubkultur sekali untuk menyediakan stok acuan. Kemurnian dan pemeriksaan biokimia harus dilakukan secara paralel secara tepat. Disarankan untuk menyimpan stok acuan dalam aliquot baik dibekukan atau liofilisasi. kultur kerja untuk penggunaan rutin harus subkultur utama dari stok acuan (lihat Lampiran 5 pada penggunaan umum dari kultur acuan). Jika stok referensi telah dicairkan, mereka tidak boleh dibekukan kembali dan digunakan kembali.
6.2.3 Stok Kerja sebaiknya tidak disubkultur. Biasanya tidak lebih dari lima generasi (atau bagian) dari strain. referensi asli dapat disubkultur jika ditentukan dengan metode standar atau laboratorium dapat memberikan bukti dokumen bahwa telah ada perubahan dalam setiap properti yang relevan. Turunan Komersial strain acuan hanya dapat digunakan sebagai kultur kerja.

7. Pengambilan contoh/sampling

7.1 Dimana laboratorium pengujian bertanggung jawab untuk sampling primer untuk mendapatkan item tes, sangat disarankan bahwa pengambilan sampel ini dilindungi oleh sistem jaminan mutu dan harus tunduk pada audit reguler.
7.2 Setiap desinfeksi proses yang digunakan untuk memperoleh sampel (misalnya disinfeksi titik sampel) tidak harus berkompromi tingkat mikroba dalam sampel.
7.3 Transportasi dan penyimpanan sampel harus di bawah kondisi yang menjaga integritas sampel (misalnya dingin atau beku jika perlu). Pengujian sampel harus dilakukan sesegera mungkin setelah pengambilan sampel. Untuk sampel di mana pertumbuhan populasi mikroba selama transportasi dan penyimpanan mungkin harus menunjukkan bahwa kondisi penyimpanan, waktu dan suhu, tidak akan mempengaruhi keakuratan hasil pengujian. Kondisi penyimpanan harus dipantau dan catatan disimpan. Tanggung jawab untuk transportasi, penyimpanan antara pengambilan sampel dan tiba di laboratorium pengujian harus didokumentasikan secara jelas.
7.4 Sampling sebaiknya hanya dilakukan oleh petugas terlatih. Ini harus dilakukan secara aseptik menggunakan peralatan steril. Tindakan pencegahan yang tepat harus diambil untuk memastikan bahwa integritas sampel dipertahankan melalui penggunaan wadah tertutup steril untuk pengumpulan sampel mana yang sesuai. Mungkin perlu untuk memantau kondisi lingkungan, misalnya, pencemaran udara dan suhu, di lokasi pengambilan sampel. Waktu pengambilan sampel harus dicatat, jika sesuai.

Metode Analisa Pemeriksaan Listeria monocytogenes

Metode panalisa pemeriksaan Listeria monocytogenes ini merujuk pada ISO 11290-1:1996/Amd.1:2004

Peralatan:
1. Autoclave
2. Incubator
3. Water bath
4. Loop
5. pH meter
6. Tabung reaksi
7. Pipet
8. Cawan petri
9. Timbangan
10. Spritus
11. Sendok steril

Bahan/ media:
1. Media pengkayaan selektif utama: Half Fraser broth
2. Media pengkayaan selektif sekunder: Fraser broth
3. Media Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA)
4. Media selektif sekunder: Oxford agar
5. Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA)
6. Tryptone soya yeast extract broth (TSYEB)
7. Sheep blood agar
8. Carbohydrate utilization broth (rhamnose and xylose)
9. Motility agar
10. CAMP ( Christie, Atkins, Munch-Petersen) medium and test strains
11. Hydrogen peroxide solution
12. Phosphate-buffered saline (PBS)

Langkah kerja:
1. Campurkan 25 gram sampel uji dengan 225 ml media pengkayaan selektif utama di dalam plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik. Inkubasi dalam incubator dengan suhu 30°C selama 24 jam ± 2 jam.
2. Campurkan 0,1 ml kultur media pengkayaan selektif utama dengan 10 ml media pengkayaan selektif sekunder. Inkubasi dalam incubator pada suhu 35°C-37°C selama 48 jam ± 3 jam.
3. Inokulasikan kultur dari media pengkayaan selektif utama ke media ALOA dan Oxford agar. Balikan cawan petri dan inkubasi kultur dengan media ALOA pada suhu 37°C selama 24 jam ± 3 jam. Jika diperlukan waktu tambahan selama selama 24 jam ± 3 jam. Balikan cawan petri dan inkubasikan kultur dengan media Oxford agar selama 24-48 jam pada suhu 30°C, 35°C, atau 37°C secara aerobic.
4. Inokulasikan kultur dari media pengkayaan selektif sekunder ke media ALOA dan Oxford agar, balikan cawan petri dan inkubasi kultur dengan media ALOA pada suhu 37°C selama 24 jam ± 3 jam. Jika diperlukan waktu tambahan selama selama 24 jam ± 3 jam. Balikam cawan petri, inkubasikan kultur dengan media Oxford agar selama 24-48 jam pada suhu 30°C, 35°C, atau 37°C secara aerobic.
5. Apabila Setelah inkubasi selama 24 jam ± 3 jam (dan untuk 24 jam tambahan ± 3 jam jika pertumbuhan lemah atau jika tidak ada koloni diamati setelah inkubasi 24 jam) untuk Media ALOA atau untuk waktu yang tepat (media selektif skeunder), periksa cawan petri untuk kehadiran koloni yang diduga Listeria spp.
6. Identifikasi L. monocytogenes pada media ALOA sebagai koloni hijau-biru dikelilingi oleh halo opak (koloni yang khas). Jika pertumbuhan sedikit, atau jika tidak ada koloni yang diamati, atau jika tidak ada koloni yang khas hadir setelah 24 jam ± 3 jam inkubasi, inkubasi kembali cawan untuk 24 jam selanjutnya ± 3 jam. Setelah 24 jam inkubasi, L.monocytogenes pada media Oxford agar tampak sebagai koloni kecil keabu-abuan berdiameter 1 mm dikelilingi halo hitam. Setelah 48 jam inkubasi, L.monocytogenes pada media Oxford agar tampak sebagai koloni kehijauan berdiameter 2 mm dengan halo hitam dan cekungan di tengah.
7. Konfirmasi dari Listeria spp. :
- Untuk konfirmasi, ambil dari setiap cawan petri, minimal 5 koloni yang dicurigai sebagai Listeria spp. Inokulasi koloni tersebut pada TSYEA. Inkubasi pada suhu 35-37°C selama 18-24 jam/ hingga terjadi pertumbuhan. - Uji reaksi katalis: ambil koloni kultur pada media TSYEA, campurkan dengan 1 tetes larutan hidrogen peroksida pada slide kaca. Pembentukan gelembung gas menunjukkan reaksi yang positif.
- Uji pewarnaan gram: lakukan pewarnaan gram koloni yang dicurigai. L. monocytogenes tampak sebagai gram positif , kurus, dan berbatang pendek.
- Uji motility: ambil koloni kultur pada media TSYEA, masukkan ke dalam tabung berisi TSYEB. Inkubasi pada suhu 25°C selama 8-24 jam hingga medium berawan. Ambil 1 tetes kultur menggunakan loop, letakkan pada slide kaca, periksa dengan mikroskop. Listeria spp. tampak kurus, berbatang pendek, dan bergerak aktif bergerak.
8. Konfirmasi L. monocytogenes:
- Uji hemolisis: jika pada tahap konfirmasi Listeria spp. didapatkan positif, ambil koloni kultur yang dicurigai, inokulasi pada sheep blood agar dengan menggunakan kawat ke beberapa cawan petri, inkubasi pada suhu 35°C / 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
*L. monocytogenes tampak sempit, jelas, memiliki zona cahaya (β-haemolysis), L. innocua tampak memiliki zona tidak jelas, L. seegeri menunjukkan zona lemah dari hemolisis, dan L. ivanovii tampak lebar, dengan jelas menunjukkan zona β-haemolysis.
- Uji penggunaan karbohidrat: inokulasi pada carbohydrate utilization broth dengan menggunakan loop, koloni kultur pada media TSYEB. Inkubasi pada suhu 35°C / 37°C selama 5 hari. Reaksi positif (pembentukan asam) ditunjukkan dengan warna kuning yang umumnya terjadi pada hari ke-1 hingga ke-2.
- Uji CAMP: Gores setiap kultur Staphylococcus aureus dan Rhodococcus equi pada satu baris di cawan petri berisi sheep blood agar sehingga dua kultur paralel dan diametris berlawanan. Gores koloni kultur pada media TYSEA yang dicurigai dengan cara yang sama pada sudut kanan kultur ini, sehingga kultur Staphylococcus aureus dan Rhodococcus equi tidak saling bersentuhan, tetapi terpisah sekitar 1 mm - 2 mm. Gores pula kultur control dari L. monocytogenes, L. innocua, L. Ivanovii. Inukbasi pada suhu 35°C / 37°C selama 18-24 jam, apabila cawan diisikan 2 lapis maka inkubasi pada 12-18 jam.
*perubahan besar pada zona β-haemolysis pada titik potong pertemuan dari Staphylococcus aureus dan Rhodococcus equi dianggap sebagai reaksi positif.
*reaksi positif dengan Rhodococcus equi tampak lebar menyerupai kepala-panah (5 mm -10 mm). Reaksi dianggap negatif bila zona kecil dari haemolysis lemah tampak sekitar 1 mm pada titik potong pertemuan antara koloni yang dicurigai dengan kultur Rhodococcus equi.
*reaksi positif dengan S.aureus tampak sebagai zona haemolysis kecil sekitar 2 mm. zona besar dari heaemolysis tidak terjadi pada S.aureus dan L. Monocytogenes.
9. Interpretasi dari konfirmasi

Keterangan:
V: reaksi bervariasi
(+): reaksi lemah
- : tidak ada reaksi
+ : >90% reaksi positif

Metode Analisa Pemeriksaan Salmonella

Refrensi Metode Analisa Pemeriksaan Salmonella ISO 6579:2002

Peralatan:
1. Autoclave
2. Oven
3. Incubator
4. Water bath
5. Loop
6. Tabung reaksi
7. Pipet
8. Cawan petri
9. Timbangan
10. Spiritus
11. Sendok steril

Bahan/ media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Rappaport-Vassilliadis medium with soya (RVS broth)
3. Muller-Kauffmann tetrathionate novobiocin broth (MKTTn broth)
4. Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar)
5. Briliant green agar (BGA)
6. Nutrient agar
7. Triple sugar/ iron agar (TSI agar)
8. Urea agar (Christensen)
9. L-lysine decarboxylation medium
10. Reagent detection of β-galactosidase
11. Reagent for voges-proskauer (VP) reaction
12. Reagent indole reaction
13. Semi-solid nutrient agar
14. Physiological saline solution

Langkah kerja:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik. Inkubasi dalam incubator selama 18 jam ± 2 jam pada suhu 37oC ± 1oC.
2. Pindahkan 0,1 ml kultur dengan BPW ke dalam tabung berisi 10 ml RVS broth. Inkubasi dalam incubator pada suhu 41,5oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Pindahkan 1 ml kultur dengan BPW ke dalam tabung berisi MKTTn broth. Inkubasi dalam incubator pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
3. Setelah masa inkubasi, inokulasikan kultur dengan RVS broth pada 2 cawan petri berisi XLD agar dan 2 cawan petri berisi BGA agar.
4. Inokulasikan kultur dengan MKTTn broth pada 2 cawan petri berisi XLD agar dan 2 cawan petri berisi BGA. 5. Balikan semua cawan petri. Inkubasikan cawan perti berisi media XLD dengan suhu 37oC selama 24 jam ± 3 jam dan cawan petri berisi BGA dengan suhu 35oC selama 18-24 jam.
6. Setelah waktu inkubasi, periksa cawan petri untuk kehadiran Salmonella atau koloni lain. Koloni Salmonella yang tumbuh di XLD agar memiliki pusat hitam dan zona transparan ringan kemerah-merahan.
* Salmonella paratyphi A yang tumbuh di XLD berwarna pink dengan pusat pink gelap sedangkan Lactose-positif Salmonella berwarna kuning denga atau tanpa pengelapan.
7. Koloni Salmonella yang tumbuh pada BGA berwarna merah/ pink/ putih buram dikelilingi dengan zona merah.
8. Untuk melakukan konfirmasi, inokulasi koloni yang dicurigai sebagai Salmonella yang tumbuh pada media XLD maupun BGA masing-masing pada Nutrient agar. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
9. Lakukan konfirmasi biokimia:
- Inokulasikan koloni kultur pada media Nutrient agar pada TSI agar. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
Interpretasi dari hasil yang muncul:
Pada dasar
kuning = Glukosa (+) (digunakan)
merah/ tidak berubah = glukosa (-) (tidak digunakan)
hitam = pembentukan hidrogen sulfide
gelembung/ retakan = pembentukan gas dari glukosa

Pada area miring
kuning = (+) sukrosa/ laktosa
merah/ tidak berubah = (-) sukrosa/ laktosa

*Kultur Salmonella menunjukkan warna merah pada area miring dan kuning dengan pembentukan gelembung dan gas hidrogen sulfide (agar menjadi mengelap).
*Lactose-positif Salmonella menunjukkan warna kuning pada area miring.
- Inokulasikan kultur pada media Nutrient agar pada area miring. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam.
Jika reaksi positif, terjadi pemisahan urea dan ammonia sehingga terjadi perubahan warna phenol dari merah ke pink, dan kelamaan menjadi merah ceri. Reaksi umunya muncul setelah 2-4 jam.
- Inokulasikan kultur pada media Nutrient agar pada L-lysine decarboxylation medium. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Reaksi positif ditunjukkan dengan kekeruhan dan warna ungu, sedangkan reaksi negatif fitunjukkan dengan warna kuning.
- Pindah kultur pada media Nutrient agar ke dalam tabung berisi 0,25 ml larutan saline dengan menggunakan loop. Tambahkan 1 tetes toluene dan kocok tabung. Simpan tabung dalam water bath dengan suhu 37oC selama ± 5 menit. Tambahkan 0.25 ml reagent β-galatosidase dan kocok. Simpan tabung di dalam water bath dengan suhu 37oC selama 24 jam ± 3 jam. Reaksi positif ditandai dengan munculnya warna kuning, reaksi muncul setelah 20 menit.
- Pindah kultur pada media Nutrient agar ke dalam tabung berisi 3 ml VP medium. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Tambahkan 2 tetes larutan creatine, 3 tetes larutan ethanolic 1-naphtol, dan 2 tetes larutan potassium hydroxide, kocok setiap penambahan setiap reagen. Reaksi positif dalam waktu 15 menit ditandai dengan pembentukan warna merah atau merah terang.
- Inokulasikan kultur pada media Nutrient agar pada tabung berisi 5 ml tryptone. Inkubasi pada suhu 37oC ± 1oC selama 24 jam ± 3 jam. Setelah inkubasi, tambahkan 1 ml reagen kovacs. Reaksi positif ditandai dengan pembentukan cincin merah, sedangkan reaksi negatif ditandai dengan pembentukan cincin kuning kecoklatan.
- Dari serangkaian data reaksi uji konfirmasi, interpretasi dapat dilihat pada tabel di bawah ini:

10. Lakukan konfirmasi serological:
- Eliminasi auto-agglutinable strains: Teteskan 1 tetes larutan saline ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati. Tambahkan di tetesan tersebut menggunakan loop, bagian dari koloni yang akan diuji. Aduk dengan lembut selama 30-60 detik. Amati hasil dengan latar belakang gelap, sebaiknya dengan bantuan kaca pembesar. Jika bakteri telah mengelompok menjadi satuan, koloni dianggap mengalami auto-agglutinable, dan tidak perlu dilakukan tes berikut karena deteksi antigen tidak berhasil.
- Pemeriksaan O-antigen: Teteskan 1 tetes anti-O serum ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati, ambil satu koloni murni yang non-autoagglutinating, dengan menggunakan loop. Aduk dengan lembut selama 30-60 detik. Jika aglutinasi terjadi, reaksi dianggap positif.
- Pemeriksaan antigen Vi: Teteskan 1 tetes serum anti-Vi ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati, ambil satu koloni murni yang non-autoagglutinating, dengan menggunakan loop. Aduk dengen lembut selama 30-60 detik. Jika aglutinasi terjadi, reaksi dianggap positif.
- Pemeriksaan antigen H: Inokulasi koloni murni yang non-auto-agglutinable pada semi-solid nutrient agar. Inkubasi pada suhu 37 ° C ± 1 ° C selama 24 jam ± 3 jam. Gunakan kultur ini untuk pemeriksaan untuk antigen H, dengen meneteskan 1 tetes serum antigen H ke slide kaca yang telah dibersihkan dengan hati-hati, ambil satu koloni murni yang non-autoagglutinating, dengan menggunakan loop. Aduk dengan lembut selama 30-60 detik. Jika aglutinasi terjadi, reaksi dianggap positif.
- Interpretasi dari reaksi biokimia dan serologic

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 4)

5. Reagen dan media kultur

Laboratorium harus memastikan bahwa kualitas reagen dan media yang digunakan sesuai untuk pengujian yang bersangkutan.

5.1 Reagen

5.1.1 Laboratorium harus memeriksa kesesuaian setiap batch reagen penting untuk tes, sejak awal dan selama umur simpan.

5.2 Media

5.2.1 Media dapat dibuat sendiri atau dibeli baik sebagian atau sepenuhnya siap. Vendor media dibeli harus disetujui dan berkualitas. Vendor yang berkualitas dapat mengesahkan beberapa parameter kualitas yang tercantum selanjutnya. Promosi Pertumbuhan dan, jika sesuai, tes kinerja lain yang sesuai (lihat bagian 5.2.2) harus dilakukan pada semua media pada setiap batch dan pada setiap pengiriman. Dimana pemasok media sepenuhnya siap memenuhi syarat dan memberikan sertifikasi promosi pertumbuhan per batch media dan kondisi transportasi telah memenuhi syarat, pengguna dapat mengandalkan sertifikat produsen dengan verifikasi periodik nya atau hasil nya.
5.2.2 Kinerja media kultur yang sesuai, pengencer dan cairan suspensi lainnya harus diperiksa, bila relevan, berkaitan dengan:
- Pemulihan/recovery atau pemeliharaan kelangsungan hidup organisme sasaran. Pemulihan 50-200% (setelah inokulasi tidak lebih dari 100 unit pembentuk koloni (CFU atau cfu) harus dibuktikan;
- Penghambatan atau penekanan organisme non-target;
- Biokimia (diferensial dan diagnostik) sifat, dan
- Sifat lain yang sesuai (misalnya pH, volume dan sterilitas).
Prosedur kuantitatif untuk evaluasi pemulihan atau kelangsungan hidup lebih diutamakan.
5.2.3 Bahan baku (kedua formulasi kering komersial dan konstituen secara individu) dan media harus disimpan dalam kondisi yang sesuai yang direkomendasikan oleh produsen, misalnya sejuk, kering dan gelap. Semua wadah, terutama untuk media kering, harus tertutup rapat. Media Kering yang menggumpal atau retak atau menunjukkan perubahan warna tidak boleh digunakan.
5.2.4 Kualitas air mikrobiologi yang tepat dan yang bebas dari bakterisida, zat penghambat atau mengganggu, harus digunakan untuk persiapan kecuali metode pengujian ditentukan lain.
5.2.5 Media yang mengandung antimetabolites atau inhibitor harus disusun dengan menggunakan peralatan gelas khusus, sebagai akumulasi dari agen tersebut ke media lain bisa menghambat pertumbuhan dan deteksi mikroorganisme yang ada dalam sampel yang diuji. Jika peralatan gelas khusus tidak digunakan, prosedur cuci peralatan gelas harus divalidasi.
5.2.6 Menuangkan media setelah sterilisasi harus dilakukan di bawah aliran udara searah (UDAF) untuk meminimalkan potensi kontaminasi lingkungan. Ini harus dianggap sebagai persyaratan minimum untuk media yang akan digunakan dalam kaitannya dengan pengujian produk steril. Ini termasuk pendinginan media, tutup wadah perlu dilepaskan selama pendinginan untuk mencegah penumpukan kondensasi.
5.2.7 Media tuang yang diradiasikan mungkin memerlukan penambahan antioksidan dan scavenger radikal bebas untuk memberikan perlindungan dari efek dari proses iradiasi. Media iradiasi harus divalidasi dengan melakukan pengujian pertumbuhan promosi kuantitatif pada kedua media iradiasi dan non-radiasi.
5.2.8 umur simpan media disiapkan dalam kondisi penyimpanan yang ditentukan harus ditetapkan dan diverifikasi.
5.2.9 Batch media harus diidentifikasi dan kesesuaian dengan spesifikasi kualitas yang didokumentasikan. Untuk media dibeli laboratorium pengguna harus memastikan bahwa ia akan diberitahu oleh produsen setiap perubahan spesifikasi kualitas.
5.2.10 Media harus disiapkan sesuai dengan instruksi pabrik, dengan spesifikasi seperti waktu dan suhu untuk sterilisasi.
5.2.11 perangkat Microwave tidak boleh digunakan untuk pencairan media karena distribusi yang tidak konsisten dari proses pemanasan.

5.3 Pelabelan

5.3.1 Laboratorium harus memastikan bahwa semua reagen (termasuk larutan stok), media, dan cairan pengencer pensuspensi lainnya cukup diberi label untuk menunjukkan, sesuai, identitas, konsentrasi, kondisi penyimpanan, tanggal persiapan, tanggal kadaluwarsa divalidasi dan / atau periode penyimpanan yang dianjurkan . Penanggung jawab untuk pembuatan harus diidentifikasi dari catatan. 5.4 Resusitasi Organisme
5.4.1 Resusitasi Organisme diperlukan di mana metodologi pengujian dapat menimbulkan sel cedera. Misalnya, paparan: - Efek merugikan pengolahan, misalnya panas;
- Agen antimikroba;
- Pengawet;
- Tekanan osmotik Ekstrim , dan
- Ekstrim pH.
5.4.2 Organisme resusitasi dapat dicapai dengan:
- Paparan media cair seperti larutan garam sederhana pada suhu kamar selama 2 jam;
- Paparan media perbaikan padat selama 4-6 jam.

Metode analisa Pemeriksaan Staphylococcus aureus

Metode analisa Pemeriksaan Staphylococcus aureus merupakan metode yang mengambil refrensi ISO 6888-1:199/Amd.1:2003

Peralatan :
1. Autoclave
2. Inkubator
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm
4. Pipet dengan kapasitas 1 ml
5. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 440C- 470C
6. tabung atau botol
7. loop atau kawat
8. Penyebar
9. Timbangan
10. Spiritus
11. Sendok steril

Bahan dan media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Baird Parker agar medium
3. Brain-heart infusion broth
4. Rabbit plasma

Langkah Kerja:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10-1) dengan pipet steril ke dalam cawan berisi media Baird Parker agar. Ambil cawan petri berisi Baird Parker agar lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Ratakan suspense dengan hati-hati dan cepat pada permukaan Baird Parker agar dengan spreader. Biarkan cawan petri selama 15 menit pada suhu ambient hingga inokulum meresap ke dalam agar.
4. Balikan cawan petri dan tempatkan dalam inkubator pada 35°C atau 37°C selama 24 jam ± 2 jam, inkubasi kembali selama 24 jam ± 2 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Setelah masa inkubasi 24 jam ± 2 jam, hitung banyaknya koloni pada cawan petri dengan jumlah maksimal 300 koloni (150 koloni atipikal). Salah satu dari cawan petri berisi minimal 15 koloni.
*Koloni tipikal yang muncul berwarna hitam atau abu-abu, terang, cembung (berdiameter 1-1,5 mm setelah 24 jam inkubasi dan 1,5-2,5 mm setelah 48 jam inkubasi), dan dikelilingi oleh zona transparan.
*Koloni atipikal tampak sebagai koloni abu-abu tanpa zona transparan atau koloni hitam terang dengan/ tanpa ujung berwarna putih dan sempit, tidak tampak cincin opak dan zona transparan.
*kehadiran bakteri lain yang mirip dengan bakteri Staphylococci dapat dibedakan dengan pemeriksaan pewarnaan gram.
6. Lakukan konfirmasi dengan:
- Pilih koloni yang dicurigai pada setiap cawan petri, ambil kultur menggunakan loop/ kawat steril, inokulasikan pada tabung berisi brain heart infusion broth, inkubasi pada suhu 35°C atau 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
- Pindahkan 0,1 ml kultur pada brain heart infusion broth ke dalam tabung berisi 0,3 ml rabbit plasma, inkubasi pada suhu 35°C atau 37°C. Amati tabung setelah 4-6 jam inkubasi, miringkan tabung dan amati penggumpalan yang terjadi. Jika belum terjadi penggumpalan, inkubasikan kembali selama 24 jam.
- Test koagulasi bereaksi positif apabila volume penggumpalan melebihi ½ volume dari isi tabung.
7. Perhitungan jumlah koloni pada sampel, gunakan rumus di bawah ini;
a= b/A x C
b= jumlah koloni pada pengenceran 10-1 yang menunjukkan hasil positif pada saat identifikasi
A= jumlah koloni yang diuji
C= jumlah koloni pada cawan petri
Setelah itu masukkan ke dalam rumus;
N = Σa/(V×1,1×d)
V = volume inokulum yang dimasukan ke dalam setiap cawan petri
D = pengenceran pertama yang dilakukan
8. Setelah selesai melakukan penghitungan dan pencatatan koloni, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121oC selama 15 menit.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 3)

4.3.5 otoklaf, termasuk Persiapan Media

4.3.5.1 otoklaf harus mampu memenuhistandar waktu dan temperatur sterilisasi, pemantauan tekanan saja tidak dapat diterima. Sensor yang digunakan untuk mengontrol atau memantau siklus operasi memerlukan kalibrasi dan kinerja timer harus diverifikasi.
4.3.5.2 validasi awal harus mencakup studi kinerja (survei distribusi temperatur ruang autoklaf) untuk setiap siklus operasi dan setiap konfigurasi beban yang digunakan dalam praktek. Proses ini harus diulang setelah setiap ada perbaikan yang signifikan atau modifikasi (misalnya penggantian penyetelan/setting thermoregulator atau programmer, mengubah beban muat atau pengaturan siklus operasi. Validasi dan revalidasi harus mempertimbangkan kesesuaian datang dan turun kali serta waktu pada suhu sterilisasi.
4.3.5.3 Instruksi kerja yang jelas harus ditetapkan berdasarkan profil pemanasan yang ditentukan untuk keperluan khusus selama validasi / revalidasi. Kriteria penerimaan / penolakan harus dibuat dan catatan operasi autoclave, termasuk suhu dan waktu, disimpan untuk setiap siklus.
4.3.5.4 Pemantauan bisa diperoleh misalnya dengan salah satu cara berikut:
- Menggunakan termokopel dan perekam untuk menghasilkan grafik atau cetakan;
- Pengamatan langsung dan pencatatan suhu maksimum dicapai dan waktu pada suhu tersebut.
Selain secara langsung memonitor suhu autoclave, efektivitas operasi selama setiap siklus dapat diperiksa dengan menggunakan indikator kimia atau biologis untuk tujuan sterilisasi atau dekontaminasi. Autoclave tape atau Indikator harus digunakan hanya untuk menunjukkan bahwa muatan telah diproses, tidak untuk menunjukkan penyelesaian siklus diterima.
Laboratorium harus memiliki autoclave terpisah untuk dekontaminasi/destruksi. Namun, dalam kasus luar biasa satu autoclave dapat diterima asalkan tindakan pencegahan dekontaminasi terpisah dan saat sterilisasi, dan program pembersihan didokumentasikan meliputi lingkungan internal dan eksternal dari autoklaf.

4.3.6 Neraca dan anak timbabang

Neraca dan anak timbabang harus dikalibrasi secara berkala dan tertelusur (sesuai dengan tujuan penggunaannya) menggunakan anak timbang sesuai standar yang tertelusur ke anak timbang standar bersertifikat.
4.3.7 Peralatan volumetrik
4.3.7.1 laboratorium Mikrobiologi harus melakukan verifikasi awal peralatan volumetrik (dispenser otomatis, dispenser / pengencer, pipet tangan mekanik dan pipet sekali pakai). Melakukan pemeriksaan rutin untuk memastikan bahwa peralatan ini dalam kondisi sesuai spesifikasi yang dibutuhkan. Verifikasi awal seharusnya tidak perlu untuk alat gelas yang telah disertifikasi untuk toleransi tertentu misal gelas piala(backer glass). Peralatan harus diperiksa adalah peralatan yang menggunakan pengaturan volume, untuk memastikan volume yang dipindahkan/dipiipet telah sesuai.
4.3.7.2 Untuk peralatan volumetrik "sekali pakai”, laboratorium harus mendapatkan pasokan dari supplier dengan sistem mutu yang diakui dan relevan. Setelah melakuakn validasi awal terhadap kesesuaian peralatan, dianjurkan untuk melakukan pemeriksaan acak untuk memastikan akurasi. Jika supplier tidak memiliki sistem mutu yang diakui, laboratorium harus memeriksa setiap batch peralatan untuk kesesuaian.
4.3.8 Peralatan lainnya
Conductivity meter, oxygen meter, pH meters dan instrumen serupa lainnya harus diverifikasi secara berkala atau sebelum setiap kali digunakan. Buffer digunakan untuk keperluan verifikasi harus disimpan dalam kondisi yang sesuai dan harus ditandai dengan tanggal kadaluwarsa.
Jika kelembaban berpengaruh terhadap hasil tes, hygrometers harus dikalibrasi, kalibrasi yang tertelusur ke standar nasional atau internasional.
Timer, termasuk timer autoclave, harus diverifikasi menggunakan dikalibrasi waktu atau sinyal waktu nasional. Ketika sentrifugal digunakan dalam prosedur pengujian, penilaian terhadap rotasi per menit (RPM) harus dibuat. jika hasil sentrifge berpengaruh terhadap hasil pengujian maka centrifuge harus dikalibrasi.

Metode Analisa Pemeriksaan Escherichia coli

Metode Analisa mikrobiologi Pemeriksaan Escherichia coli berdasarkan refrensi ISO 16649-2:2001

Peralatan:

1. Autoclave
2. Inkubator
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm
4. Pipet dengan kapasitas 1 ml
5. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 44°C- 47°C
6. tabung atau botol
7. Timbangan
8. Spiritus
9. Sendok steril

Bahan/ media:

1. Maximum recovery diluents
2. Tryptone-bile-glucoronic medium (TBX)

Langkah Kerja:

1. Campurkan 180 ml diluents dengan 20 gram sampel yang akan diuji ke dalam plastic steril, lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10^-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10^-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10^-1) dengan pipet steril ke dalam cawan. Ambil cawan petri steril lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10^-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Tuangkan sekitar 15 ml media TBX (44°C hingga 47°C) ke dalam setiap cawan petri. Lama waktu antara inokulasi suspense awal (atau pengenceran 10^-1) dan saat ketika media dituangkan ke cawan petri tidak akan boleh melebihi 15 menit. Campurkan inokulum dengan media dengan memutar cawan Petri secara hati-hati dan biarkan campuran memadat dengan meninggalkan cawan Petri berdiri pada permukaan horizontal dingin.
4. Balikan cawan petri dan tempatkan dalam inkubator pada 44°C selama 18 jam-24 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Setelah masa inkubasi yang ditentukan, hitung banyaknya koloni pada cawan petri. Periksa cawan petri di bawah cahaya terang. Hitung banyaknya koloni tipikal CFU dari Escherichia coli β-glucurodinase yang tumbuh pada cawan berjumlah kurang dari 150 koloni CFU dan kurang dari 300 total koloni (tipikal dan non tipikal) CFU.
6. Perhitungan jumlah koloni pada sampel:
- Apabila jumlah koloni CFU yang tumbuh pada 1 cawan petri paling sedikit 15 koloni, gunakan rumus di bawah ini:
N = Σa / (V(n1+0,1n2)d)
Σa = jumlah koloni pada kedua cawan petri, dengan setidak-tidaknya satu cawan petri berisi 15 koloni.
n1 = jumlah cawan petri untuk pengenceran 10-1
n2 = jumlah cawan petri untuk pengenceran 10-2
V = volume yang diinokulasi pada setiap cawan petri
d = faktor pengenceran pertama (10^-1)
- Apabila koloni yang tumbuh pada kedua cawan petri berjumlah kurang dari 15 maka gunakan rumus di bawah ini:
NE= Σc/(V(n)d)
Σc = jumlah koloni pada kedua cawan petri
N = jumlah cawan petri yang digunakan (n=2)
V = volume yang diinokulasi pada setiap cawan petri
d = faktor pengenceran pertama (10^-1)
7. Setelah selesai melakukan penghitungan dan pencatatan koloni, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121°C selama 15 menit.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 2)

3. Validasi metode uji

3.1 Metode uji standar tetap harus divalidasi. Selain itu, metode tes khusus yang digunakan oleh laboratorium untuk pengujian produk tertentu harus terbukti cocok untuk digunakan dalam memulihkan/recovery bakteri, jamur dan kapang yang terdapat pada produk tertentu tersebut. Laboratorium harus menunjukkan bahwa unjuk kerja metode uji standar dapat dipenuhi oleh laboratorium sebelum menggunakan metode tersebut untuk pengujian rutin (metode terverifikasi) dan juga metode tes (khusus untuk produk tertenu) telah memperlihatkan hasil uji yang sama dengan uji pada positif dan negatif kontrol.
3.2 Metode pengujian tidak berdasarkan metode standar atau referensi lain yang diakui harus divalidasi sebelum digunakan. Validasi harus terdiri, dimana tepat, menentukan akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas dan ketahanan. Potensi dampak penghambatan dari sampel harus diperhitungkan ketika menguji berbagai jenis sampel. Hasil harus dievaluasi dengan metode statistik yang sesuai, misalnya seperti yang dijelaskan dalam farmakope nasional, regional maupun internasional.

4. peralatan

Setiap item peralatan, instrumen atau perangkat yang digunakan untuk pengujian, verifikasi dan kalibrasi harus diidentifikasi secara unik. Sebagai bagian dari sistem mutu, laboratorium harus memiliki program terdokumentasi untuk kualifikasi, kalibrasi, verifikasi kinerja, pemeliharaan dan sistem untuk memantau penggunaan peralatannya.
4.1 Pemeliharaan peralatan
4.1.1 Pemeliharaan peralatan yang sangat penting harus dilakukan secara berkala sesuai dengan prosedur yang terdokumentasi. Catatan rinci harus disimpan.
4.2 Kalibrasi, verifikasi dan pemantauan penggunaan.
4.2.1 Tanggal kalibrasi dan servis dan tanggal kalibrasi ulang harus jelas ditunjukkan pada label yang melekat pada instrumen.
4.2.2 Frekuensi kalibrasi dan verifikasi kinerja peralatan akan ditentukan dari unjukkerja yang terdokumentasi dan akan didasarkan pada kebutuhan, jenis dan kinerja sebelumnya. Interval antara kalibrasi dan verifikasi harus lebih pendek daripada waktu peralatan telah ditemukan untuk mengambil melayang di luar batas yang dapat diterima. Kinerja peralatan harus sesuai dengan kriteria penerimaan yang telah ditetapkan.
4.2.3 perangkat pengukuran Suhu
4.2.3.1 Apabila suhu memiliki efek langsung pada hasil analisis atau sangat penting untuk kinerja yang benar dari peralatan, alat ukur suhu harus kualitas yang tepat untuk mencapai akurasi yang diperlukan (misalnya termometer cair di kaca, termokopel dan platinum termometer resistensi (PRT) yang digunakan dalam inkubator dan otoklaf).
4.2.3.2 Kalibrasi perangkat harus sesuai dengan standar nasional atau internasional untuk suhu.
4.2.4 Inkubator, water bath dan oven
Stabilitas suhu, keseragaman distribusi suhu dan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai kondisi kesetimbangan dalam inkubator, water bath, dan suhu bagian dalam oven harus dikontrol . Perlakuan khusus sehubungan dengan penggunaan khas (misalnya, posisi, ruang antara, dan tinggi, tumpukan cawan Petri) ditetapkan dari awal dan didokumentasikan . kesetabilan karakteristik awal peralatan dicatat selama validasi dan harus diperiksa juga dicatat setelah setiap kali terjadi perbaikan yang signifikan atau modifikasi. Suhu operasi jenis peralatan harus dipantau dan catatan disimpan. Penggunaan peralatan harus dipertimbangkan ketika menentukan apakah kontrol temperatur diperlukan.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 1)

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi merupakan bagian atau penerapan dari ISO 17025 jaminan mutu laboratorium yang dikhususkan untuk laboratorium mikrobiologi.

1.personil

1.1 pengujian mikrobiologi harus dilakukan dan diawasi oleh orang yang berpengalaman, berkualifikasi dalam mikrobiologi atau setara. Staf harus memiliki pelatihan dasar mikrobiologi dan pengalaman praktis yang relevan sebelum diperbolehkan untuk melakukan pekerjaan yang tercakup dalam ruang lingkup pengujian.
1.2 deskripsi pekerjaan saat ini untuk semua personil yang terlibat dalam pengujian dan / atau kalibrasi, validasi dan verifikasi harus dipelihara. Laboratorium juga harus mempertahankan catatan dari semua tenaga teknis, yang menjelaskan kualifikasi mereka, pelatihan dan pengalaman.
1.3 Jika laboratorium menyertakan pendapat dan interpretasi hasil tes dalam laporan, ini harus dilakukan oleh petugas yang berwenang dengan pengalaman yang sesuai dan pengetahuan yang relevan dari aplikasi spesifik termasuk, misalnya, persyaratan peraturan dan teknologi dan kriteria penerimaan.
1.4 Manajemen laboratorium harus memastikan bahwa semua personel memiliki kompetensi pengujian dan pengoperasian peralatan. Serta mendapat pelatihan yang memadai,mencakup pelatihan teknik dasar misalnya analisa metode tuang, menghitung koloni, teknik aseptik, pembuatan media,membuat serial pengenceran , dan teknik dasar dalam diidentifikasi, dengan penerimaan ditentukan berdasarkan kriteria objektif yang relevan. Personil hanya dapat melakukan tes pada sampel sesuai dengan kompetensinya, atau jika tidak sesuai mereka melakukannya di bawah pengawasan yang memadai. Kompetensi harus dipantau secara kontinyu untuk menetukan pelatihan apa yang diperlukan.
Apabila suatu metode atau teknik yang digunakan buka metode rutin(metode baru), kompetensi personil untuk melakukan tes harus diverifikasi sebelum pengujian dilakukan. Dalam beberapa kasus dapat diterima untuk berkaitan kompetensi untuk teknik umum atau instrumen yang digunakan daripada metode tertentu.
1.5 Personil harus dilatih prosedur yang diperlukan untuk penyimpanan mikroorganisme dalam fasilitas laboratorium.
1.6 Personil harus dilatih penanganan mikroorganisme yang aman.

2. lingkungan

2.1 Bangunan/Gedung

2.1.1 laboratorium Mikrobiologi dan peralatan pendukung tertentu (misalnya autoklaf dan peralatan gelas) harus disediakan khusus dan dipisahkan dari area lain, terutama dari area produksi.
2.1.2 Mikrobiologi laboratorium harus dirancang agar sesuai dengan Kegiatan yang akan dilakukan di dalamnya. Harus ada ruang yang cukup untuk semua kegiatan untuk menghindari mencampur, kontaminasi dan kontaminasi silang. Harus ada ruang yang cocok cukup untuk sampel, organisme acuan, media (jika perlu, dengan pendinginan), pengujian dan catatan. Dikarenakan sifat dari beberapa bahan (misalnya, media steril terhadap organisme acuan atau budaya diinkubasi), lokasi penyimpanan terpisah mungkin diperlukan.
2.1.3 Laboratorium harus tepat dirancang dan harus mempertimbangkan kesesuaian bahan-bahan konstruksi untuk memungkinkan pembersihan yang sesuai, desinfeksi dan meminimalkan risiko kontaminasi.
2.1.4 Harus ada pasokan udara terpisah ke laboratorium dan area produksi. Unit penanganan udara terpisah dan ketentuan lainnya, termasuk kontrol suhu dan kelembaban di mana diperlukan, harus di tempat untuk laboratorium mikrobiologi. Udara disuplai ke laboratorium harus berkualitas yang tepat dan seharusnya tidak menjadi sumber kontaminasi.
2.1.5 Akses ke laboratorium mikrobiologi harus dibatasi hanya ke petugas yang berwenang. Personil harus dibuat mengetahui: - Akses yang sesuai dan prosedur memasuki dan keluar lab;
- Tujuan penggunaan daerah tertentu;
- Pembatasan yang diberlakukan area kerja dalam bidang-bidang tertentu;
- Alasan untuk menerapkan pembatasan tersebut, dan
- Tingkat isolasi yang layak.
2.1.6 kegiatan laboratorium, seperti persiapan sampel, media dan persiapan peralatan dan penghitungan mikroorganisme, harus dipisahkan oleh ruang atau setidaknya jeda waktu, sehingga dapat meminimalkan risiko kontaminasi silang, hasil positif palsu dan hasil negatif palsu. Dimana daerah non dedicated digunakan, prinsip-prinsip manajemen risiko harus diterapkan. Pengujian sterilitas harus selalu dilakukan di tempat khusus.
2.1.7 Pertimbangan harus diberikan untuk desain sesuai diklasifikasikan.
daerah untuk operasi yang akan dilakukan dalam laboratorium mikrobiologi. klasifikasi harus didasarkan pada kekritisan produk dan operasi yang dilaksanakan di daerah. Pengujian sterilitas harus dilakukan di bawah kelas yang sama seperti yang digunakan untuk operasi manufaktur steril / aseptik.
2.1.8 Secara umum, peralatan laboratorium seharusnya tidak rutin dipindahkan antara daerah kelas kebersihan yang berbeda, untuk menghindari kontaminasi silang tidak disengaja. Peralatan laboratorium yang digunakan di laboratorium mikrobiologi tidak boleh digunakan di luar wilayah mikrobiologi, kecuali ada tindakan pencegahan khusus di tempat untuk mencegah kontaminasi silang.

2.2 Pemantauan lingkungan di laboratorium.

2.2.1 Apabila diperlukan dan sesuai (misalnya di daerah untuk pengujian sterilitas) program pemantauan lingkungan harus di tempat yang meliputi, misalnya, menggunakan pemantauan udara aktif, settling udara atau pelat kontak, suhu dan perbedaan tekanan. Pemberitahuan serta tindakan batasan harus didefinisikan. Tren hasil pemantauan lingkungan harus dilaksanakan.

2.3 Pembersihan, disinfeksi dan kebersihan.

2.3.1 Harus ada dokumentasi pembersihan dan Program desinfeksi. Hasil pemantauan lingkungan harus diperhatikan.
2.3.2 Harus ada prosedur untuk menangani tumpahan.
2.3.3 Harus tersedia fasititas cici tanagn dan desinfeksi untuk tangan yang memadai.

2.4 Fasilitas Uji sterilitas 

2.4.1 Fasilitas Uji sterilitas memiliki persyaratan lingkungan yang spesifik untuk memastikan integritas tes yang dilakukan. WHO good manufacturing practices (GMP) untuk produk farmasi steril mengharuskan pengujian sterilitas harus dilakukan dan menentukan persyaratan untuk pengujian sterilitas. Bagian ini menjelaskan persyaratan clean-room untuk fasilitas uji sterilitas.
2.4.2 pengujian sterilitas harus dilakukan dalam kondisi aseptik, yang harus setara dengan standar kualitas udara yang dibutuhkan untuk pembuatan aseptik produk farmasi. Tempat, layanan dan peralatan harus tunduk pada proses kualifikasi yang sesuai.
2.4.3 pengujian sterilitas harus dilakukan dalam Kelas A dengan aliran udara satu arah pada zona proteksi ataumenggunakan lemari biosafety (jika diperlukan) yang ditempatkan dalam ruang bersih dengan latar belakang kelas B. Atau pengujian dapat dilakukan dalam ruang isolasi. Perawatan harus dilakukan sesuai desain tata letak fasilitas dan pola aliran udara ruang, untuk memastikan bahwa pola aliran udara searah tidak terganggu.
2.4.4 klasifikasi clean-room dan peralatan pengendalian udara untuk fasilitas uji sterilitas harus dikaji ulang setidaknya setahun sekali oleh orang yang kompeten atau kontraktor. Lingkungan harus sesuai dengan batas kelayakan/bakumutu dengan melakukan verifikasi HEPA filter dan pola aliran udara ruang. Frekuensi pemantauan dapat ditentukan berdasarkan manajemen risiko mutu/ quality risk management (QRM). Lokasi Pemetaan untuk titik sampel untuk pemantauan rutin harus didokumentasikan, serta lamanya paparan, dan frekuensi semua jenis pemantauan lingkungan mikrobiologi harus ditentukan dalam prosedur tertulis.
2.4.5 Udara yang disuplai ke zona kelas A dan B harus melalui terminal HEPA filter.
2.4.6 alarm untuk aliran udara yang tidak sesuai juga perbedaan tekanan dan instrumen tertentu harus disediakan (GMP: Pemanasan, ventilasi dan sistem Penyejuk untuk bentuk sediaan farmasi yang tidak steril (8), dan GMP untuk produk farmasi steril (8).
2.4.7 Pembacaan tekanan Ruangan harus diamati dan dicatat dari alat pengukur yang dipasang dari luar kecuali sistem pemantauan berkelanjutan tervalidasi telah diinstal. Minimal, pembacaan harus diambil sebelum masuknya operator untuk melakukan pengujian. Pengukur tekanan harus diberi label untuk menunjukkan area yang diperikasa dan dengan spesifikasi dapat diterima.
2.4.8 Masuk ke ruangan yang bersih (clean-room) harus melalui sistem airlocks dan ruang Ganti di mana operator diwajibkan untuk mengenakan pakaian yang sesuai untuk area bersih (clean-room). Ruang ganti diperbolehkan seperti kondisi kelas yang sama dengan ruang pelayanan (serves room). Ruang ganti harus memiliki ukuran yang memadai untuk kemudahan saat mengganti pakaian. Harus ada pembatas yang jelas dari zona yang berbeda.
2.4.9 pemantauan mikrobiologi lingkungan harus mencerminkan fasilitas yang digunakan (ruang atau isolator) dan termasuk kombinasi metode pengambilan sampel udara dan permukaan yang sesuai dengan fasilitas, seperti:
-Exsposure udara dengan mebuka cawan petri yang berisi media agar
-Swab permukaan
-pemeriksaan kontak permukaan dengn metode rodac plate atau dengan petri film
-pengecekan sarungtangan yang dikenakan oleh operator
Pemantauan mikroba dilingkungan zona uji sterilitas harus dilakukan pada tiap sesi bekerja di bawah kondisi operasional (dinamis).

PERSIAPAN DAN PEMELIHARAAN subKULTUR

kultur murni
dibutuhkan Kemampuan untuk menjaga kultur murni agar tak terkontaminasi selama inokulasi dan penggunaan dengan cara menerapkan GMLP. Kemampuan ini sangat penting untuk alasan keamanan dan untuk menjaga integritas ilmiah penelitian. Jelas kemampuan itu juga penting untuk mengenali kapan kultur telah terkontaminasi.

Menjaga stok kultur
Mungkin lebih mudah (murah) menjaga stok biakan murni daripada melakukan pemembeli kembali. Relatif mudah untuk mempertahankan sub-kultur pada media yang tepat untuk pertumbuhan, tetapi pemeliharaan stok kultur harus terorganisasi dengan baik dengan memperhatikan detail. Dipersiapkan untuk mentransfer kultur sebanyak empat kali setahun untuk mempertahankan kelangsungan hidup kultur. Mengkultur pada pelat gores (streak plates) tidak cocokdigunakan untuk kultur stok. kultur pada agar miring dibotol bertutup ulir lebih disarankan karena tutup sekrup/ulir mengurangi penguapan keluar sehingga tidak kering dan tidak dapat tumpah atau jatuh keluar. kultur pada agar miring lebih disarankan daripada dengan media kaldu (yaitu medium cair) karena tanda kontaminasi jauh lebih mudah terlihat pada permukaan media agar. Dua kultur stok harus disiapkan, salah satunya adalah " stok kerja" untuk dipakai sub-kultur untuk analisa, yang lain adalah " stok permanen" yang dibuka hanya sekali untuk menyiapkan dua kultur stok berikutnya. Inkubasi pada suhu yang tepat sampai ada pertumbuhan yang baik. Untuk pertumbuhan aerob yang ketat mungkin perlu untuk sedikit melonggarkan penutup saat inkubasi (tapi tutup secara aman sebelum penyimpanan) agar ada udara cukup pada bagian atas. Begitu ada pertumbuhan yang memadai, simpan kultur pada suhu kamar baik dalam lemari atau laci khusus. Terus waspada agar takterkontaminasi.

Memeriksa kontaminasi kultur
Bukti kultur yang murni yaitu ditandai oleh munculnya koloni pada lempeng gores dan sel dalam pengamatan mikroskopis. Harus ada keseragaman bentuk koloni dan bentuk sel (dan konsistensinya dengan penampilan kultur asli!). Hal ini masuk akal untuk memeriksa kemurnian atas dugaan kontaminasi kultur “stok kerja” dari waktu ke waktu dan dari “stock permanen” ketika mempersiapkan kultur stok baru.
Jika kultur terkontaminasi, tidak dianjurkan untuk mencoba untuk memperbaiki situasi dengan mengambil inokulum dari koloni tunggal dari streak plate dari kultur campuran karena kemungkinan (1) tidak mampu membedakan antara bentuk koloni kontaminan dan kultur asli, dan (2) varian kultur dari kultur asli yang tidak menunjukan sifat/bentuk seperti kultur asli dan sebaliknya. jika kontaminasi terjadi maka lakukan subkultur kembali dari " stok kerja" atau " stok permanen" , itulah mengapa perlu dibagi dua!.

Mencegah kontaminasi kultur dan lingkungan
Kapas penutup
penutup yang terbuat dari kapas non-penyerap(non-absorbent cotton wool) dapat digunakan pada tabung reaksi dan pipet untuk mencegah mikro-organisme melewati atau keluar dan mencemari kultur atau lingkungan. diperlukan celah cukup lebar diantara serat kapas untuk melewati aliran udara masuk dan produk gas yang dikeluaran/diproduksi mikro-organisme. Celah yang cukup lebar diantara serat kapas memungkinkan mikro-organisme/kultur keluar namun halini tidak akan terjadi karena mikro-organisme (bermuatan negatif) akan "tersaring" karena ditarik dan teradsorpsi pada kapas yang bermuatan berlawanan. Kapas harus tetap kering karena kemampuan filtrasi akan hilang jika kapas menjadi lembab - oleh karena itu digunakan kapas non penyerap(non-absorbent cotton wool). Untuk penggunaan plug (penutup kapas) pada tabung reaksi, Plug harus dibuat dengan benar untuk memastikan penutup dapat digunakan dengan nyaman tanpa mengubah bentuk saat digunakan berkali-kali (buka-tutup secara berkali-kali).

Metode Deteksi dan Perhitungan Coliform dengan teknik MPN

Berikut adalah metode dan perhitungan coliform dengan teknik MPN berdasarkan ISO 4831

Peralatan:
1. Autoclave
2. Inkubator
3. Pipet dengan kapasitas 1 ml
4. pH meter
5. Tabung dengan dimensi 16 mm x 160 mm
6. Tabung durham
7. Loop
8. Timbangan
9. Sendok steril

Bahan/ media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Lauryl sulfate trptpse broth (single strength medium)
3. Lauryl sulfate trptpse broth (double strength medium)
4. Brilliant green lactose broth

Pembuatan media:
1. Campurkan Buffered Peptone Water sebanyak 20 gram dengan 1 liter air distilasi. Aduk hingga merata. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya.
2. Campurkan 36,5 gram Lauryl sulfate trptpse broth dengan 1 liter air distilasi. Tuang media sebanyak 10 ml ke dalam tabung yang berisi tabung durham. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya. Tabung durham tidak boleh berisi gelembung setelah sterilisasi.
3. Campurkan 73 gram Lauryl sulfate trptpse broth dengan 1 liter air distilasi. Tuang media ke dalam tabung. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya.
4. Campurkan 40 gram Briliant green lactose broth dengan 1 liter air distilasi. Aduk merata, tuang media sebanyak 10 ml ke dalam tabung berisi tabung durham. Sterilkan media di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya. Tabung durham tidak boleh berisi gelembung setelah sterilisasi.


Langkah kerja:

Metode deteksi:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik.
2. Pindahkan 10 ml suspense ke dalam tabung berisi double strength medium, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam.
3. Pindahkan 1 ml suspense ke dalam tabung berisi single strength medium, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam. Apabila setelah 24 jam ± 2 jam, belum muncul reaksi pembentukan gas/ kekeruhan, inkubasikan kembali selama 24 jam ± 2 jam.
4. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media double strength dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
5. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media single strength yang menunjukkan pembentukan gas dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
6. Setelah masa inkubasi, interpretasikan tabung yang mengalami pembentukan gas sebagai tabung yang positif.

Metode perhitungan
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspense pengenceran 10-1, masukkan ke dalam tabung berisi 9 ml BPW (pengenceran 10-2), kocok hingga merata. Ambil 1 ml suspense pengenceran 10-2, masukkan ke dalam tabung berisi 9 ml BPW (pengenceran 10-3), kocok hingga merata.
2. Pindahkan 10 ml suspense (pengenceran 10-1) ke dalam 3 tabung berisi double strength medium. Pindahkan masing-masing pengenceran sebanyak 1 ml ke dalam 3 tabung berisi single strength medium. Inkubasi 3 tabung pertama pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam, dan 9 tabung berikutnya, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam. Apabila setelah 24 jam ± 2 jam, belum muncul reaksi pembentukan gas/ kekeruhan, inkubasikan kembali selama 24 jam ± 2 jam.
3. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media double strength dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
4. Setelah masa inkubasi, lakukan konfirmasi dengan mengambil kultur pada media single strength setiap pengenceran yang menunjukkan pembentukan gas/ kekeruhan dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
5. Pada semua tabung uji setiap pengenceran, hitung jumlah tabung yang menunjukkan reaksi positif (pembentukan gas).