Peralatan:
1. Autoclave
2. Incubator
3. Water bath
4. Loop
5. pH meter
6. Tabung reaksi
7. Pipet
8. Cawan petri
9. Timbangan
10. Spritus
11. Sendok steril
Bahan/ media:
1. Media pengkayaan selektif utama: Half Fraser broth
2. Media pengkayaan selektif sekunder: Fraser broth
3. Media Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA)
4. Media selektif sekunder: Oxford agar
5. Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA)
6. Tryptone soya yeast extract broth (TSYEB)
7. Sheep blood agar
8. Carbohydrate utilization broth (rhamnose and xylose)
9. Motility agar
10. CAMP ( Christie, Atkins, Munch-Petersen) medium and test strains
11. Hydrogen peroxide solution
12. Phosphate-buffered saline (PBS)
Langkah kerja:
1. Campurkan 25 gram sampel uji dengan 225 ml media pengkayaan selektif utama di dalam plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik. Inkubasi dalam incubator dengan suhu 30°C selama 24 jam ± 2 jam.
2. Campurkan 0,1 ml kultur media pengkayaan selektif utama dengan 10 ml media pengkayaan selektif sekunder. Inkubasi dalam incubator pada suhu 35°C-37°C selama 48 jam ± 3 jam.
3. Inokulasikan kultur dari media pengkayaan selektif utama ke media ALOA dan Oxford agar. Balikan cawan petri dan inkubasi kultur dengan media ALOA pada suhu 37°C selama 24 jam ± 3 jam. Jika diperlukan waktu tambahan selama selama 24 jam ± 3 jam. Balikan cawan petri dan inkubasikan kultur dengan media Oxford agar selama 24-48 jam pada suhu 30°C, 35°C, atau 37°C secara aerobic.
4. Inokulasikan kultur dari media pengkayaan selektif sekunder ke media ALOA dan Oxford agar, balikan cawan petri dan inkubasi kultur dengan media ALOA pada suhu 37°C selama 24 jam ± 3 jam. Jika diperlukan waktu tambahan selama selama 24 jam ± 3 jam. Balikam cawan petri, inkubasikan kultur dengan media Oxford agar selama 24-48 jam pada suhu 30°C, 35°C, atau 37°C secara aerobic.
5. Apabila Setelah inkubasi selama 24 jam ± 3 jam (dan untuk 24 jam tambahan ± 3 jam jika pertumbuhan lemah atau jika tidak ada koloni diamati setelah inkubasi 24 jam) untuk Media ALOA atau untuk waktu yang tepat (media selektif skeunder), periksa cawan petri untuk kehadiran koloni yang diduga Listeria spp.
6. Identifikasi L. monocytogenes pada media ALOA sebagai koloni hijau-biru dikelilingi oleh halo opak (koloni yang khas). Jika pertumbuhan sedikit, atau jika tidak ada koloni yang diamati, atau jika tidak ada koloni yang khas hadir setelah 24 jam ± 3 jam inkubasi, inkubasi kembali cawan untuk 24 jam selanjutnya ± 3 jam. Setelah 24 jam inkubasi, L.monocytogenes pada media Oxford agar tampak sebagai koloni kecil keabu-abuan berdiameter 1 mm dikelilingi halo hitam. Setelah 48 jam inkubasi, L.monocytogenes pada media Oxford agar tampak sebagai koloni kehijauan berdiameter 2 mm dengan halo hitam dan cekungan di tengah.
7. Konfirmasi dari Listeria spp. :
- Untuk konfirmasi, ambil dari setiap cawan petri, minimal 5 koloni yang dicurigai sebagai Listeria spp. Inokulasi koloni tersebut pada TSYEA. Inkubasi pada suhu 35-37°C selama 18-24 jam/ hingga terjadi pertumbuhan. - Uji reaksi katalis: ambil koloni kultur pada media TSYEA, campurkan dengan 1 tetes larutan hidrogen peroksida pada slide kaca. Pembentukan gelembung gas menunjukkan reaksi yang positif.
- Uji pewarnaan gram: lakukan pewarnaan gram koloni yang dicurigai. L. monocytogenes tampak sebagai gram positif , kurus, dan berbatang pendek.
- Uji motility: ambil koloni kultur pada media TSYEA, masukkan ke dalam tabung berisi TSYEB. Inkubasi pada suhu 25°C selama 8-24 jam hingga medium berawan. Ambil 1 tetes kultur menggunakan loop, letakkan pada slide kaca, periksa dengan mikroskop. Listeria spp. tampak kurus, berbatang pendek, dan bergerak aktif bergerak.
8. Konfirmasi L. monocytogenes:
- Uji hemolisis: jika pada tahap konfirmasi Listeria spp. didapatkan positif, ambil koloni kultur yang dicurigai, inokulasi pada sheep blood agar dengan menggunakan kawat ke beberapa cawan petri, inkubasi pada suhu 35°C / 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
*L. monocytogenes tampak sempit, jelas, memiliki zona cahaya (β-haemolysis), L. innocua tampak memiliki zona tidak jelas, L. seegeri menunjukkan zona lemah dari hemolisis, dan L. ivanovii tampak lebar, dengan jelas menunjukkan zona β-haemolysis.
- Uji penggunaan karbohidrat: inokulasi pada carbohydrate utilization broth dengan menggunakan loop, koloni kultur pada media TSYEB. Inkubasi pada suhu 35°C / 37°C selama 5 hari. Reaksi positif (pembentukan asam) ditunjukkan dengan warna kuning yang umumnya terjadi pada hari ke-1 hingga ke-2.
- Uji CAMP: Gores setiap kultur Staphylococcus aureus dan Rhodococcus equi pada satu baris di cawan petri berisi sheep blood agar sehingga dua kultur paralel dan diametris berlawanan. Gores koloni kultur pada media TYSEA yang dicurigai dengan cara yang sama pada sudut kanan kultur ini, sehingga kultur Staphylococcus aureus dan Rhodococcus equi tidak saling bersentuhan, tetapi terpisah sekitar 1 mm - 2 mm. Gores pula kultur control dari L. monocytogenes, L. innocua, L. Ivanovii. Inukbasi pada suhu 35°C / 37°C selama 18-24 jam, apabila cawan diisikan 2 lapis maka inkubasi pada 12-18 jam.
*perubahan besar pada zona β-haemolysis pada titik potong pertemuan dari Staphylococcus aureus dan Rhodococcus equi dianggap sebagai reaksi positif.
*reaksi positif dengan Rhodococcus equi tampak lebar menyerupai kepala-panah (5 mm -10 mm). Reaksi dianggap negatif bila zona kecil dari haemolysis lemah tampak sekitar 1 mm pada titik potong pertemuan antara koloni yang dicurigai dengan kultur Rhodococcus equi.
*reaksi positif dengan S.aureus tampak sebagai zona haemolysis kecil sekitar 2 mm. zona besar dari heaemolysis tidak terjadi pada S.aureus dan L. Monocytogenes.
9. Interpretasi dari konfirmasi
V: reaksi bervariasi
(+): reaksi lemah
- : tidak ada reaksi
+ : >90% reaksi positif
nice membantu banget makasih
ReplyDeletebeli voucher google play di alfamart