Metode analisa Pemeriksaan Staphylococcus aureus

Metode analisa Pemeriksaan Staphylococcus aureus merupakan metode yang mengambil refrensi ISO 6888-1:199/Amd.1:2003

Peralatan :
1. Autoclave
2. Inkubator
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm
4. Pipet dengan kapasitas 1 ml
5. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 440C- 470C
6. tabung atau botol
7. loop atau kawat
8. Penyebar
9. Timbangan
10. Spiritus
11. Sendok steril

Bahan dan media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Baird Parker agar medium
3. Brain-heart infusion broth
4. Rabbit plasma

Langkah Kerja:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10-1) dengan pipet steril ke dalam cawan berisi media Baird Parker agar. Ambil cawan petri berisi Baird Parker agar lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Ratakan suspense dengan hati-hati dan cepat pada permukaan Baird Parker agar dengan spreader. Biarkan cawan petri selama 15 menit pada suhu ambient hingga inokulum meresap ke dalam agar.
4. Balikan cawan petri dan tempatkan dalam inkubator pada 35°C atau 37°C selama 24 jam ± 2 jam, inkubasi kembali selama 24 jam ± 2 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Setelah masa inkubasi 24 jam ± 2 jam, hitung banyaknya koloni pada cawan petri dengan jumlah maksimal 300 koloni (150 koloni atipikal). Salah satu dari cawan petri berisi minimal 15 koloni.
*Koloni tipikal yang muncul berwarna hitam atau abu-abu, terang, cembung (berdiameter 1-1,5 mm setelah 24 jam inkubasi dan 1,5-2,5 mm setelah 48 jam inkubasi), dan dikelilingi oleh zona transparan.
*Koloni atipikal tampak sebagai koloni abu-abu tanpa zona transparan atau koloni hitam terang dengan/ tanpa ujung berwarna putih dan sempit, tidak tampak cincin opak dan zona transparan.
*kehadiran bakteri lain yang mirip dengan bakteri Staphylococci dapat dibedakan dengan pemeriksaan pewarnaan gram.
6. Lakukan konfirmasi dengan:
- Pilih koloni yang dicurigai pada setiap cawan petri, ambil kultur menggunakan loop/ kawat steril, inokulasikan pada tabung berisi brain heart infusion broth, inkubasi pada suhu 35°C atau 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
- Pindahkan 0,1 ml kultur pada brain heart infusion broth ke dalam tabung berisi 0,3 ml rabbit plasma, inkubasi pada suhu 35°C atau 37°C. Amati tabung setelah 4-6 jam inkubasi, miringkan tabung dan amati penggumpalan yang terjadi. Jika belum terjadi penggumpalan, inkubasikan kembali selama 24 jam.
- Test koagulasi bereaksi positif apabila volume penggumpalan melebihi ½ volume dari isi tabung.
7. Perhitungan jumlah koloni pada sampel, gunakan rumus di bawah ini;
a= b/A x C
b= jumlah koloni pada pengenceran 10-1 yang menunjukkan hasil positif pada saat identifikasi
A= jumlah koloni yang diuji
C= jumlah koloni pada cawan petri
Setelah itu masukkan ke dalam rumus;
N = Σa/(V×1,1×d)
V = volume inokulum yang dimasukan ke dalam setiap cawan petri
D = pengenceran pertama yang dilakukan
8. Setelah selesai melakukan penghitungan dan pencatatan koloni, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121oC selama 15 menit.