Metode analisa Pemeriksaan Staphylococcus aureus

Metode analisa Pemeriksaan Staphylococcus aureus merupakan metode yang mengambil refrensi ISO 6888-1:199/Amd.1:2003

Peralatan :
1. Autoclave
2. Inkubator
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm
4. Pipet dengan kapasitas 1 ml
5. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 440C- 470C
6. tabung atau botol
7. loop atau kawat
8. Penyebar
9. Timbangan
10. Spiritus
11. Sendok steril

Bahan dan media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Baird Parker agar medium
3. Brain-heart infusion broth
4. Rabbit plasma

Langkah Kerja:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10-1) dengan pipet steril ke dalam cawan berisi media Baird Parker agar. Ambil cawan petri berisi Baird Parker agar lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Ratakan suspense dengan hati-hati dan cepat pada permukaan Baird Parker agar dengan spreader. Biarkan cawan petri selama 15 menit pada suhu ambient hingga inokulum meresap ke dalam agar.
4. Balikan cawan petri dan tempatkan dalam inkubator pada 35°C atau 37°C selama 24 jam ± 2 jam, inkubasi kembali selama 24 jam ± 2 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Setelah masa inkubasi 24 jam ± 2 jam, hitung banyaknya koloni pada cawan petri dengan jumlah maksimal 300 koloni (150 koloni atipikal). Salah satu dari cawan petri berisi minimal 15 koloni.
*Koloni tipikal yang muncul berwarna hitam atau abu-abu, terang, cembung (berdiameter 1-1,5 mm setelah 24 jam inkubasi dan 1,5-2,5 mm setelah 48 jam inkubasi), dan dikelilingi oleh zona transparan.
*Koloni atipikal tampak sebagai koloni abu-abu tanpa zona transparan atau koloni hitam terang dengan/ tanpa ujung berwarna putih dan sempit, tidak tampak cincin opak dan zona transparan.
*kehadiran bakteri lain yang mirip dengan bakteri Staphylococci dapat dibedakan dengan pemeriksaan pewarnaan gram.
6. Lakukan konfirmasi dengan:
- Pilih koloni yang dicurigai pada setiap cawan petri, ambil kultur menggunakan loop/ kawat steril, inokulasikan pada tabung berisi brain heart infusion broth, inkubasi pada suhu 35°C atau 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
- Pindahkan 0,1 ml kultur pada brain heart infusion broth ke dalam tabung berisi 0,3 ml rabbit plasma, inkubasi pada suhu 35°C atau 37°C. Amati tabung setelah 4-6 jam inkubasi, miringkan tabung dan amati penggumpalan yang terjadi. Jika belum terjadi penggumpalan, inkubasikan kembali selama 24 jam.
- Test koagulasi bereaksi positif apabila volume penggumpalan melebihi ½ volume dari isi tabung.
7. Perhitungan jumlah koloni pada sampel, gunakan rumus di bawah ini;
a= b/A x C
b= jumlah koloni pada pengenceran 10-1 yang menunjukkan hasil positif pada saat identifikasi
A= jumlah koloni yang diuji
C= jumlah koloni pada cawan petri
Setelah itu masukkan ke dalam rumus;
N = Σa/(V×1,1×d)
V = volume inokulum yang dimasukan ke dalam setiap cawan petri
D = pengenceran pertama yang dilakukan
8. Setelah selesai melakukan penghitungan dan pencatatan koloni, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121oC selama 15 menit.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 3)

4.3.5 otoklaf, termasuk Persiapan Media

4.3.5.1 otoklaf harus mampu memenuhistandar waktu dan temperatur sterilisasi, pemantauan tekanan saja tidak dapat diterima. Sensor yang digunakan untuk mengontrol atau memantau siklus operasi memerlukan kalibrasi dan kinerja timer harus diverifikasi.
4.3.5.2 validasi awal harus mencakup studi kinerja (survei distribusi temperatur ruang autoklaf) untuk setiap siklus operasi dan setiap konfigurasi beban yang digunakan dalam praktek. Proses ini harus diulang setelah setiap ada perbaikan yang signifikan atau modifikasi (misalnya penggantian penyetelan/setting thermoregulator atau programmer, mengubah beban muat atau pengaturan siklus operasi. Validasi dan revalidasi harus mempertimbangkan kesesuaian datang dan turun kali serta waktu pada suhu sterilisasi.
4.3.5.3 Instruksi kerja yang jelas harus ditetapkan berdasarkan profil pemanasan yang ditentukan untuk keperluan khusus selama validasi / revalidasi. Kriteria penerimaan / penolakan harus dibuat dan catatan operasi autoclave, termasuk suhu dan waktu, disimpan untuk setiap siklus.
4.3.5.4 Pemantauan bisa diperoleh misalnya dengan salah satu cara berikut:
- Menggunakan termokopel dan perekam untuk menghasilkan grafik atau cetakan;
- Pengamatan langsung dan pencatatan suhu maksimum dicapai dan waktu pada suhu tersebut.
Selain secara langsung memonitor suhu autoclave, efektivitas operasi selama setiap siklus dapat diperiksa dengan menggunakan indikator kimia atau biologis untuk tujuan sterilisasi atau dekontaminasi. Autoclave tape atau Indikator harus digunakan hanya untuk menunjukkan bahwa muatan telah diproses, tidak untuk menunjukkan penyelesaian siklus diterima.
Laboratorium harus memiliki autoclave terpisah untuk dekontaminasi/destruksi. Namun, dalam kasus luar biasa satu autoclave dapat diterima asalkan tindakan pencegahan dekontaminasi terpisah dan saat sterilisasi, dan program pembersihan didokumentasikan meliputi lingkungan internal dan eksternal dari autoklaf.

4.3.6 Neraca dan anak timbabang

Neraca dan anak timbabang harus dikalibrasi secara berkala dan tertelusur (sesuai dengan tujuan penggunaannya) menggunakan anak timbang sesuai standar yang tertelusur ke anak timbang standar bersertifikat.
4.3.7 Peralatan volumetrik
4.3.7.1 laboratorium Mikrobiologi harus melakukan verifikasi awal peralatan volumetrik (dispenser otomatis, dispenser / pengencer, pipet tangan mekanik dan pipet sekali pakai). Melakukan pemeriksaan rutin untuk memastikan bahwa peralatan ini dalam kondisi sesuai spesifikasi yang dibutuhkan. Verifikasi awal seharusnya tidak perlu untuk alat gelas yang telah disertifikasi untuk toleransi tertentu misal gelas piala(backer glass). Peralatan harus diperiksa adalah peralatan yang menggunakan pengaturan volume, untuk memastikan volume yang dipindahkan/dipiipet telah sesuai.
4.3.7.2 Untuk peralatan volumetrik "sekali pakai”, laboratorium harus mendapatkan pasokan dari supplier dengan sistem mutu yang diakui dan relevan. Setelah melakuakn validasi awal terhadap kesesuaian peralatan, dianjurkan untuk melakukan pemeriksaan acak untuk memastikan akurasi. Jika supplier tidak memiliki sistem mutu yang diakui, laboratorium harus memeriksa setiap batch peralatan untuk kesesuaian.
4.3.8 Peralatan lainnya
Conductivity meter, oxygen meter, pH meters dan instrumen serupa lainnya harus diverifikasi secara berkala atau sebelum setiap kali digunakan. Buffer digunakan untuk keperluan verifikasi harus disimpan dalam kondisi yang sesuai dan harus ditandai dengan tanggal kadaluwarsa.
Jika kelembaban berpengaruh terhadap hasil tes, hygrometers harus dikalibrasi, kalibrasi yang tertelusur ke standar nasional atau internasional.
Timer, termasuk timer autoclave, harus diverifikasi menggunakan dikalibrasi waktu atau sinyal waktu nasional. Ketika sentrifugal digunakan dalam prosedur pengujian, penilaian terhadap rotasi per menit (RPM) harus dibuat. jika hasil sentrifge berpengaruh terhadap hasil pengujian maka centrifuge harus dikalibrasi.

Metode Analisa Pemeriksaan Escherichia coli

Metode Analisa mikrobiologi Pemeriksaan Escherichia coli berdasarkan refrensi ISO 16649-2:2001

Peralatan:

1. Autoclave
2. Inkubator
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm
4. Pipet dengan kapasitas 1 ml
5. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 44°C- 47°C
6. tabung atau botol
7. Timbangan
8. Spiritus
9. Sendok steril

Bahan/ media:

1. Maximum recovery diluents
2. Tryptone-bile-glucoronic medium (TBX)

Langkah Kerja:

1. Campurkan 180 ml diluents dengan 20 gram sampel yang akan diuji ke dalam plastic steril, lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10^-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10^-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10^-1) dengan pipet steril ke dalam cawan. Ambil cawan petri steril lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10^-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Tuangkan sekitar 15 ml media TBX (44°C hingga 47°C) ke dalam setiap cawan petri. Lama waktu antara inokulasi suspense awal (atau pengenceran 10^-1) dan saat ketika media dituangkan ke cawan petri tidak akan boleh melebihi 15 menit. Campurkan inokulum dengan media dengan memutar cawan Petri secara hati-hati dan biarkan campuran memadat dengan meninggalkan cawan Petri berdiri pada permukaan horizontal dingin.
4. Balikan cawan petri dan tempatkan dalam inkubator pada 44°C selama 18 jam-24 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Setelah masa inkubasi yang ditentukan, hitung banyaknya koloni pada cawan petri. Periksa cawan petri di bawah cahaya terang. Hitung banyaknya koloni tipikal CFU dari Escherichia coli β-glucurodinase yang tumbuh pada cawan berjumlah kurang dari 150 koloni CFU dan kurang dari 300 total koloni (tipikal dan non tipikal) CFU.
6. Perhitungan jumlah koloni pada sampel:
- Apabila jumlah koloni CFU yang tumbuh pada 1 cawan petri paling sedikit 15 koloni, gunakan rumus di bawah ini:
N = Σa / (V(n1+0,1n2)d)
Σa = jumlah koloni pada kedua cawan petri, dengan setidak-tidaknya satu cawan petri berisi 15 koloni.
n1 = jumlah cawan petri untuk pengenceran 10-1
n2 = jumlah cawan petri untuk pengenceran 10-2
V = volume yang diinokulasi pada setiap cawan petri
d = faktor pengenceran pertama (10^-1)
- Apabila koloni yang tumbuh pada kedua cawan petri berjumlah kurang dari 15 maka gunakan rumus di bawah ini:
NE= Σc/(V(n)d)
Σc = jumlah koloni pada kedua cawan petri
N = jumlah cawan petri yang digunakan (n=2)
V = volume yang diinokulasi pada setiap cawan petri
d = faktor pengenceran pertama (10^-1)
7. Setelah selesai melakukan penghitungan dan pencatatan koloni, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121°C selama 15 menit.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 2)

3. Validasi metode uji

3.1 Metode uji standar tetap harus divalidasi. Selain itu, metode tes khusus yang digunakan oleh laboratorium untuk pengujian produk tertentu harus terbukti cocok untuk digunakan dalam memulihkan/recovery bakteri, jamur dan kapang yang terdapat pada produk tertentu tersebut. Laboratorium harus menunjukkan bahwa unjuk kerja metode uji standar dapat dipenuhi oleh laboratorium sebelum menggunakan metode tersebut untuk pengujian rutin (metode terverifikasi) dan juga metode tes (khusus untuk produk tertenu) telah memperlihatkan hasil uji yang sama dengan uji pada positif dan negatif kontrol.
3.2 Metode pengujian tidak berdasarkan metode standar atau referensi lain yang diakui harus divalidasi sebelum digunakan. Validasi harus terdiri, dimana tepat, menentukan akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linieritas dan ketahanan. Potensi dampak penghambatan dari sampel harus diperhitungkan ketika menguji berbagai jenis sampel. Hasil harus dievaluasi dengan metode statistik yang sesuai, misalnya seperti yang dijelaskan dalam farmakope nasional, regional maupun internasional.

4. peralatan

Setiap item peralatan, instrumen atau perangkat yang digunakan untuk pengujian, verifikasi dan kalibrasi harus diidentifikasi secara unik. Sebagai bagian dari sistem mutu, laboratorium harus memiliki program terdokumentasi untuk kualifikasi, kalibrasi, verifikasi kinerja, pemeliharaan dan sistem untuk memantau penggunaan peralatannya.
4.1 Pemeliharaan peralatan
4.1.1 Pemeliharaan peralatan yang sangat penting harus dilakukan secara berkala sesuai dengan prosedur yang terdokumentasi. Catatan rinci harus disimpan.
4.2 Kalibrasi, verifikasi dan pemantauan penggunaan.
4.2.1 Tanggal kalibrasi dan servis dan tanggal kalibrasi ulang harus jelas ditunjukkan pada label yang melekat pada instrumen.
4.2.2 Frekuensi kalibrasi dan verifikasi kinerja peralatan akan ditentukan dari unjukkerja yang terdokumentasi dan akan didasarkan pada kebutuhan, jenis dan kinerja sebelumnya. Interval antara kalibrasi dan verifikasi harus lebih pendek daripada waktu peralatan telah ditemukan untuk mengambil melayang di luar batas yang dapat diterima. Kinerja peralatan harus sesuai dengan kriteria penerimaan yang telah ditetapkan.
4.2.3 perangkat pengukuran Suhu
4.2.3.1 Apabila suhu memiliki efek langsung pada hasil analisis atau sangat penting untuk kinerja yang benar dari peralatan, alat ukur suhu harus kualitas yang tepat untuk mencapai akurasi yang diperlukan (misalnya termometer cair di kaca, termokopel dan platinum termometer resistensi (PRT) yang digunakan dalam inkubator dan otoklaf).
4.2.3.2 Kalibrasi perangkat harus sesuai dengan standar nasional atau internasional untuk suhu.
4.2.4 Inkubator, water bath dan oven
Stabilitas suhu, keseragaman distribusi suhu dan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai kondisi kesetimbangan dalam inkubator, water bath, dan suhu bagian dalam oven harus dikontrol . Perlakuan khusus sehubungan dengan penggunaan khas (misalnya, posisi, ruang antara, dan tinggi, tumpukan cawan Petri) ditetapkan dari awal dan didokumentasikan . kesetabilan karakteristik awal peralatan dicatat selama validasi dan harus diperiksa juga dicatat setelah setiap kali terjadi perbaikan yang signifikan atau modifikasi. Suhu operasi jenis peralatan harus dipantau dan catatan disimpan. Penggunaan peralatan harus dipertimbangkan ketika menentukan apakah kontrol temperatur diperlukan.

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi (bagian 1)

Jaminan Mutu Laboratorium Mikrobiologi merupakan bagian atau penerapan dari ISO 17025 jaminan mutu laboratorium yang dikhususkan untuk laboratorium mikrobiologi.

1.personil

1.1 pengujian mikrobiologi harus dilakukan dan diawasi oleh orang yang berpengalaman, berkualifikasi dalam mikrobiologi atau setara. Staf harus memiliki pelatihan dasar mikrobiologi dan pengalaman praktis yang relevan sebelum diperbolehkan untuk melakukan pekerjaan yang tercakup dalam ruang lingkup pengujian.
1.2 deskripsi pekerjaan saat ini untuk semua personil yang terlibat dalam pengujian dan / atau kalibrasi, validasi dan verifikasi harus dipelihara. Laboratorium juga harus mempertahankan catatan dari semua tenaga teknis, yang menjelaskan kualifikasi mereka, pelatihan dan pengalaman.
1.3 Jika laboratorium menyertakan pendapat dan interpretasi hasil tes dalam laporan, ini harus dilakukan oleh petugas yang berwenang dengan pengalaman yang sesuai dan pengetahuan yang relevan dari aplikasi spesifik termasuk, misalnya, persyaratan peraturan dan teknologi dan kriteria penerimaan.
1.4 Manajemen laboratorium harus memastikan bahwa semua personel memiliki kompetensi pengujian dan pengoperasian peralatan. Serta mendapat pelatihan yang memadai,mencakup pelatihan teknik dasar misalnya analisa metode tuang, menghitung koloni, teknik aseptik, pembuatan media,membuat serial pengenceran , dan teknik dasar dalam diidentifikasi, dengan penerimaan ditentukan berdasarkan kriteria objektif yang relevan. Personil hanya dapat melakukan tes pada sampel sesuai dengan kompetensinya, atau jika tidak sesuai mereka melakukannya di bawah pengawasan yang memadai. Kompetensi harus dipantau secara kontinyu untuk menetukan pelatihan apa yang diperlukan.
Apabila suatu metode atau teknik yang digunakan buka metode rutin(metode baru), kompetensi personil untuk melakukan tes harus diverifikasi sebelum pengujian dilakukan. Dalam beberapa kasus dapat diterima untuk berkaitan kompetensi untuk teknik umum atau instrumen yang digunakan daripada metode tertentu.
1.5 Personil harus dilatih prosedur yang diperlukan untuk penyimpanan mikroorganisme dalam fasilitas laboratorium.
1.6 Personil harus dilatih penanganan mikroorganisme yang aman.

2. lingkungan

2.1 Bangunan/Gedung

2.1.1 laboratorium Mikrobiologi dan peralatan pendukung tertentu (misalnya autoklaf dan peralatan gelas) harus disediakan khusus dan dipisahkan dari area lain, terutama dari area produksi.
2.1.2 Mikrobiologi laboratorium harus dirancang agar sesuai dengan Kegiatan yang akan dilakukan di dalamnya. Harus ada ruang yang cukup untuk semua kegiatan untuk menghindari mencampur, kontaminasi dan kontaminasi silang. Harus ada ruang yang cocok cukup untuk sampel, organisme acuan, media (jika perlu, dengan pendinginan), pengujian dan catatan. Dikarenakan sifat dari beberapa bahan (misalnya, media steril terhadap organisme acuan atau budaya diinkubasi), lokasi penyimpanan terpisah mungkin diperlukan.
2.1.3 Laboratorium harus tepat dirancang dan harus mempertimbangkan kesesuaian bahan-bahan konstruksi untuk memungkinkan pembersihan yang sesuai, desinfeksi dan meminimalkan risiko kontaminasi.
2.1.4 Harus ada pasokan udara terpisah ke laboratorium dan area produksi. Unit penanganan udara terpisah dan ketentuan lainnya, termasuk kontrol suhu dan kelembaban di mana diperlukan, harus di tempat untuk laboratorium mikrobiologi. Udara disuplai ke laboratorium harus berkualitas yang tepat dan seharusnya tidak menjadi sumber kontaminasi.
2.1.5 Akses ke laboratorium mikrobiologi harus dibatasi hanya ke petugas yang berwenang. Personil harus dibuat mengetahui: - Akses yang sesuai dan prosedur memasuki dan keluar lab;
- Tujuan penggunaan daerah tertentu;
- Pembatasan yang diberlakukan area kerja dalam bidang-bidang tertentu;
- Alasan untuk menerapkan pembatasan tersebut, dan
- Tingkat isolasi yang layak.
2.1.6 kegiatan laboratorium, seperti persiapan sampel, media dan persiapan peralatan dan penghitungan mikroorganisme, harus dipisahkan oleh ruang atau setidaknya jeda waktu, sehingga dapat meminimalkan risiko kontaminasi silang, hasil positif palsu dan hasil negatif palsu. Dimana daerah non dedicated digunakan, prinsip-prinsip manajemen risiko harus diterapkan. Pengujian sterilitas harus selalu dilakukan di tempat khusus.
2.1.7 Pertimbangan harus diberikan untuk desain sesuai diklasifikasikan.
daerah untuk operasi yang akan dilakukan dalam laboratorium mikrobiologi. klasifikasi harus didasarkan pada kekritisan produk dan operasi yang dilaksanakan di daerah. Pengujian sterilitas harus dilakukan di bawah kelas yang sama seperti yang digunakan untuk operasi manufaktur steril / aseptik.
2.1.8 Secara umum, peralatan laboratorium seharusnya tidak rutin dipindahkan antara daerah kelas kebersihan yang berbeda, untuk menghindari kontaminasi silang tidak disengaja. Peralatan laboratorium yang digunakan di laboratorium mikrobiologi tidak boleh digunakan di luar wilayah mikrobiologi, kecuali ada tindakan pencegahan khusus di tempat untuk mencegah kontaminasi silang.

2.2 Pemantauan lingkungan di laboratorium.

2.2.1 Apabila diperlukan dan sesuai (misalnya di daerah untuk pengujian sterilitas) program pemantauan lingkungan harus di tempat yang meliputi, misalnya, menggunakan pemantauan udara aktif, settling udara atau pelat kontak, suhu dan perbedaan tekanan. Pemberitahuan serta tindakan batasan harus didefinisikan. Tren hasil pemantauan lingkungan harus dilaksanakan.

2.3 Pembersihan, disinfeksi dan kebersihan.

2.3.1 Harus ada dokumentasi pembersihan dan Program desinfeksi. Hasil pemantauan lingkungan harus diperhatikan.
2.3.2 Harus ada prosedur untuk menangani tumpahan.
2.3.3 Harus tersedia fasititas cici tanagn dan desinfeksi untuk tangan yang memadai.

2.4 Fasilitas Uji sterilitas 

2.4.1 Fasilitas Uji sterilitas memiliki persyaratan lingkungan yang spesifik untuk memastikan integritas tes yang dilakukan. WHO good manufacturing practices (GMP) untuk produk farmasi steril mengharuskan pengujian sterilitas harus dilakukan dan menentukan persyaratan untuk pengujian sterilitas. Bagian ini menjelaskan persyaratan clean-room untuk fasilitas uji sterilitas.
2.4.2 pengujian sterilitas harus dilakukan dalam kondisi aseptik, yang harus setara dengan standar kualitas udara yang dibutuhkan untuk pembuatan aseptik produk farmasi. Tempat, layanan dan peralatan harus tunduk pada proses kualifikasi yang sesuai.
2.4.3 pengujian sterilitas harus dilakukan dalam Kelas A dengan aliran udara satu arah pada zona proteksi ataumenggunakan lemari biosafety (jika diperlukan) yang ditempatkan dalam ruang bersih dengan latar belakang kelas B. Atau pengujian dapat dilakukan dalam ruang isolasi. Perawatan harus dilakukan sesuai desain tata letak fasilitas dan pola aliran udara ruang, untuk memastikan bahwa pola aliran udara searah tidak terganggu.
2.4.4 klasifikasi clean-room dan peralatan pengendalian udara untuk fasilitas uji sterilitas harus dikaji ulang setidaknya setahun sekali oleh orang yang kompeten atau kontraktor. Lingkungan harus sesuai dengan batas kelayakan/bakumutu dengan melakukan verifikasi HEPA filter dan pola aliran udara ruang. Frekuensi pemantauan dapat ditentukan berdasarkan manajemen risiko mutu/ quality risk management (QRM). Lokasi Pemetaan untuk titik sampel untuk pemantauan rutin harus didokumentasikan, serta lamanya paparan, dan frekuensi semua jenis pemantauan lingkungan mikrobiologi harus ditentukan dalam prosedur tertulis.
2.4.5 Udara yang disuplai ke zona kelas A dan B harus melalui terminal HEPA filter.
2.4.6 alarm untuk aliran udara yang tidak sesuai juga perbedaan tekanan dan instrumen tertentu harus disediakan (GMP: Pemanasan, ventilasi dan sistem Penyejuk untuk bentuk sediaan farmasi yang tidak steril (8), dan GMP untuk produk farmasi steril (8).
2.4.7 Pembacaan tekanan Ruangan harus diamati dan dicatat dari alat pengukur yang dipasang dari luar kecuali sistem pemantauan berkelanjutan tervalidasi telah diinstal. Minimal, pembacaan harus diambil sebelum masuknya operator untuk melakukan pengujian. Pengukur tekanan harus diberi label untuk menunjukkan area yang diperikasa dan dengan spesifikasi dapat diterima.
2.4.8 Masuk ke ruangan yang bersih (clean-room) harus melalui sistem airlocks dan ruang Ganti di mana operator diwajibkan untuk mengenakan pakaian yang sesuai untuk area bersih (clean-room). Ruang ganti diperbolehkan seperti kondisi kelas yang sama dengan ruang pelayanan (serves room). Ruang ganti harus memiliki ukuran yang memadai untuk kemudahan saat mengganti pakaian. Harus ada pembatas yang jelas dari zona yang berbeda.
2.4.9 pemantauan mikrobiologi lingkungan harus mencerminkan fasilitas yang digunakan (ruang atau isolator) dan termasuk kombinasi metode pengambilan sampel udara dan permukaan yang sesuai dengan fasilitas, seperti:
-Exsposure udara dengan mebuka cawan petri yang berisi media agar
-Swab permukaan
-pemeriksaan kontak permukaan dengn metode rodac plate atau dengan petri film
-pengecekan sarungtangan yang dikenakan oleh operator
Pemantauan mikroba dilingkungan zona uji sterilitas harus dilakukan pada tiap sesi bekerja di bawah kondisi operasional (dinamis).

PERSIAPAN DAN PEMELIHARAAN subKULTUR

kultur murni
dibutuhkan Kemampuan untuk menjaga kultur murni agar tak terkontaminasi selama inokulasi dan penggunaan dengan cara menerapkan GMLP. Kemampuan ini sangat penting untuk alasan keamanan dan untuk menjaga integritas ilmiah penelitian. Jelas kemampuan itu juga penting untuk mengenali kapan kultur telah terkontaminasi.

Menjaga stok kultur
Mungkin lebih mudah (murah) menjaga stok biakan murni daripada melakukan pemembeli kembali. Relatif mudah untuk mempertahankan sub-kultur pada media yang tepat untuk pertumbuhan, tetapi pemeliharaan stok kultur harus terorganisasi dengan baik dengan memperhatikan detail. Dipersiapkan untuk mentransfer kultur sebanyak empat kali setahun untuk mempertahankan kelangsungan hidup kultur. Mengkultur pada pelat gores (streak plates) tidak cocokdigunakan untuk kultur stok. kultur pada agar miring dibotol bertutup ulir lebih disarankan karena tutup sekrup/ulir mengurangi penguapan keluar sehingga tidak kering dan tidak dapat tumpah atau jatuh keluar. kultur pada agar miring lebih disarankan daripada dengan media kaldu (yaitu medium cair) karena tanda kontaminasi jauh lebih mudah terlihat pada permukaan media agar. Dua kultur stok harus disiapkan, salah satunya adalah " stok kerja" untuk dipakai sub-kultur untuk analisa, yang lain adalah " stok permanen" yang dibuka hanya sekali untuk menyiapkan dua kultur stok berikutnya. Inkubasi pada suhu yang tepat sampai ada pertumbuhan yang baik. Untuk pertumbuhan aerob yang ketat mungkin perlu untuk sedikit melonggarkan penutup saat inkubasi (tapi tutup secara aman sebelum penyimpanan) agar ada udara cukup pada bagian atas. Begitu ada pertumbuhan yang memadai, simpan kultur pada suhu kamar baik dalam lemari atau laci khusus. Terus waspada agar takterkontaminasi.

Memeriksa kontaminasi kultur
Bukti kultur yang murni yaitu ditandai oleh munculnya koloni pada lempeng gores dan sel dalam pengamatan mikroskopis. Harus ada keseragaman bentuk koloni dan bentuk sel (dan konsistensinya dengan penampilan kultur asli!). Hal ini masuk akal untuk memeriksa kemurnian atas dugaan kontaminasi kultur “stok kerja” dari waktu ke waktu dan dari “stock permanen” ketika mempersiapkan kultur stok baru.
Jika kultur terkontaminasi, tidak dianjurkan untuk mencoba untuk memperbaiki situasi dengan mengambil inokulum dari koloni tunggal dari streak plate dari kultur campuran karena kemungkinan (1) tidak mampu membedakan antara bentuk koloni kontaminan dan kultur asli, dan (2) varian kultur dari kultur asli yang tidak menunjukan sifat/bentuk seperti kultur asli dan sebaliknya. jika kontaminasi terjadi maka lakukan subkultur kembali dari " stok kerja" atau " stok permanen" , itulah mengapa perlu dibagi dua!.

Mencegah kontaminasi kultur dan lingkungan
Kapas penutup
penutup yang terbuat dari kapas non-penyerap(non-absorbent cotton wool) dapat digunakan pada tabung reaksi dan pipet untuk mencegah mikro-organisme melewati atau keluar dan mencemari kultur atau lingkungan. diperlukan celah cukup lebar diantara serat kapas untuk melewati aliran udara masuk dan produk gas yang dikeluaran/diproduksi mikro-organisme. Celah yang cukup lebar diantara serat kapas memungkinkan mikro-organisme/kultur keluar namun halini tidak akan terjadi karena mikro-organisme (bermuatan negatif) akan "tersaring" karena ditarik dan teradsorpsi pada kapas yang bermuatan berlawanan. Kapas harus tetap kering karena kemampuan filtrasi akan hilang jika kapas menjadi lembab - oleh karena itu digunakan kapas non penyerap(non-absorbent cotton wool). Untuk penggunaan plug (penutup kapas) pada tabung reaksi, Plug harus dibuat dengan benar untuk memastikan penutup dapat digunakan dengan nyaman tanpa mengubah bentuk saat digunakan berkali-kali (buka-tutup secara berkali-kali).

Metode Deteksi dan Perhitungan Coliform dengan teknik MPN

Berikut adalah metode dan perhitungan coliform dengan teknik MPN berdasarkan ISO 4831

Peralatan:
1. Autoclave
2. Inkubator
3. Pipet dengan kapasitas 1 ml
4. pH meter
5. Tabung dengan dimensi 16 mm x 160 mm
6. Tabung durham
7. Loop
8. Timbangan
9. Sendok steril

Bahan/ media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Lauryl sulfate trptpse broth (single strength medium)
3. Lauryl sulfate trptpse broth (double strength medium)
4. Brilliant green lactose broth

Pembuatan media:
1. Campurkan Buffered Peptone Water sebanyak 20 gram dengan 1 liter air distilasi. Aduk hingga merata. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya.
2. Campurkan 36,5 gram Lauryl sulfate trptpse broth dengan 1 liter air distilasi. Tuang media sebanyak 10 ml ke dalam tabung yang berisi tabung durham. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya. Tabung durham tidak boleh berisi gelembung setelah sterilisasi.
3. Campurkan 73 gram Lauryl sulfate trptpse broth dengan 1 liter air distilasi. Tuang media ke dalam tabung. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya.
4. Campurkan 40 gram Briliant green lactose broth dengan 1 liter air distilasi. Aduk merata, tuang media sebanyak 10 ml ke dalam tabung berisi tabung durham. Sterilkan media di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya. Tabung durham tidak boleh berisi gelembung setelah sterilisasi.


Langkah kerja:

Metode deteksi:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik.
2. Pindahkan 10 ml suspense ke dalam tabung berisi double strength medium, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam.
3. Pindahkan 1 ml suspense ke dalam tabung berisi single strength medium, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam. Apabila setelah 24 jam ± 2 jam, belum muncul reaksi pembentukan gas/ kekeruhan, inkubasikan kembali selama 24 jam ± 2 jam.
4. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media double strength dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
5. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media single strength yang menunjukkan pembentukan gas dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
6. Setelah masa inkubasi, interpretasikan tabung yang mengalami pembentukan gas sebagai tabung yang positif.

Metode perhitungan
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspense pengenceran 10-1, masukkan ke dalam tabung berisi 9 ml BPW (pengenceran 10-2), kocok hingga merata. Ambil 1 ml suspense pengenceran 10-2, masukkan ke dalam tabung berisi 9 ml BPW (pengenceran 10-3), kocok hingga merata.
2. Pindahkan 10 ml suspense (pengenceran 10-1) ke dalam 3 tabung berisi double strength medium. Pindahkan masing-masing pengenceran sebanyak 1 ml ke dalam 3 tabung berisi single strength medium. Inkubasi 3 tabung pertama pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam, dan 9 tabung berikutnya, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam. Apabila setelah 24 jam ± 2 jam, belum muncul reaksi pembentukan gas/ kekeruhan, inkubasikan kembali selama 24 jam ± 2 jam.
3. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media double strength dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
4. Setelah masa inkubasi, lakukan konfirmasi dengan mengambil kultur pada media single strength setiap pengenceran yang menunjukkan pembentukan gas/ kekeruhan dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
5. Pada semua tabung uji setiap pengenceran, hitung jumlah tabung yang menunjukkan reaksi positif (pembentukan gas).

Teknik aseptik dasar

INOKULASI DAN TATA aseptik LAINNYA

poin penting
Ada beberapa tindakan pencegahan penting yang harus diambil selama prosedur inokulasi untuk mengontrol peluang bagi kontaminasi kultur , orang atau lingkungan .
• Praktikum tdak dapat dimulai sampai semua persyaratan dalam jangkauan langsung dan harus diselesaikan sebagai secepat mungkin .
• Kapal harus terbuka untuk jumlah waktu minimum yang mungkin dan sementara mereka terbuka semua pekerjaan harus dilakukan dekat pembakar api Bunsen mana arus udara yang ditarik ke atas.
• Pada dibuka , leher tabung reaksi atau botol harus segera hangat oleh menyala sehingga udara apapun Gerakan adalah keluar dan kapal diadakan sedekat mungkin dengan horizontal.
• Selama manipulasi yang melibatkan cawan Petri , paparan permukaan dalam steril untuk kontaminasi dari udara harus terbatas pada minimum absolut .
• Bagian dari pipet steril yang akan dimasukkan ke dalam kultur atau pembuluh steril tidak harus disentuh atau dibiarkan datang dalam kontak dengan permukaan yang tidak steril lainnya , misalnya pakaian, permukaan wilayah kerja , di luar testabung / botol .

Menggunakan kawat loop
Loop kawat disterilisasi menggunakan panas merah dalam api Bunsen sebelum dan setelah digunakan . Mereka harus dipanaskan sampai merah panas untuk memastikan bahwa setiap mencemari spora bakteri dihancurkan . Gagang loop kawat diadakan dekat dengan restoran, seperti yang akan Anda pena , pada sudut yang hampir vertikal. Ini meninggalkan jari kelingking bebas untuk mengambil memegang kapaswol steker / sekrup tutup tabung / botol tes .

Flaming prosedur
Prosedur menyala dirancang untuk memanaskan akhir loop secara bertahap karena setelah digunakan akan berisi kultur , yang mungkin " tersedak " pada pemanasan cepat dengan kemungkinan melepaskan partikel kecil kultur dan aerosol formasi.
1 . Posisi pegangan ujung kawat dalam kerucut cahaya biru dari nyala api . Ini adalah daerah dingin api .
2 . Gambarkan sisa kawat ke atas perlahan-lahan sampai ke daerah terpanas api , ( tepat di atas kerucut biru muda) .
3 . Tahan ada sampai panas merah .
4 . Pastikan panjang penuh kawat menerima pemanasan yang memadai .
5 . Biarkan dingin kemudian gunakan segera.
6 . Jangan menaruh loop bawah atau gelombang sekitar.

petunjuk
Jika lingkaran tidak tahan cairan apapun loop belum membuat lingkaran lengkap. Untuk memperbaiki masalah ini, pertama memastikan bahwa loop telah disterilkan dan kemudian membentuk lingkaran dengan forsep. Jangan gunakan jari Anda karena kemungkinan menusuk kulit.

Menggunakan pipet
Steril lulus atau menjatuhkan ( Pasteur ) pipet yang digunakan untuk mentransfer kultur , media yang steril dan solusi steril .
1 . Lepaskan pipet dari wadah / wrapper pada akhir yang berisi wol steker kapas, merawat untuk menyentuh tidak lebih dari jumlah yang diperlukan untuk mengambil suatu pegangan yang kuat .
2 . Fit dot .
3 . Pegang pipet barel seperti yang Anda lakukan pena tetapi tidak memahami dot .
Jari kelingking dibiarkan bebas untuk mengambil terus dari kapas steker / tutup tabung reaksi / botol dan jempol untuk mengontrol dot .
4 . Tekan dot hati-hati dan mengambil sejumlah cairan yang cukup untuk jumlah yang diperlukan tetapi tidak mencapai dan basah wol steker kapas .
5 . Mengembalikan kelebihan apapun lembut jika volume diukur diperlukan .
Pipet tip harus tetap di bawah permukaan cairan saat mengambil cairan untuk menghindari pengenalan gelembung udara yang dapat menyebabkan " meludah " dan, akibatnya , pembentukan aerosol ketika cairan dikeluarkan.
6 . Segera menempatkan pipet sekarang terkontaminasi ke dalam panci membuang terdekat disinfektan . Dot tidak boleh dihapus sampai pipet berada dalam pot membuang dinyatakan tetes kultur akan mencemari permukaan kerja.

petunjuk
Sebuah pipet bocor disebabkan oleh salah satu dot rusak atau tidak pas atau serat dari wol steker kapas antara dot dan pipet .Menjatuhkan A ( Pasteur ) pipet dapat dikonversi untuk memberikan volume diukur dengan melampirkan ke sebuah steril jarum suntik barel pipa karet .

Flaming leher botol dan tabung reaksi
1. Longgarkan tutup botol sehingga dapat dihapus dengan mudah.
2. Angkat botol / tabung reaksi dengan tangan kiri.
3. Lepaskan tutup botol / kapas pasang dengan jari kelingking tangan kanan. (Putar botol, tidak tutupnya.)
4. Jangan meletakkan tutup / kapas plug.
5. Flame leher botol / tabung reaksi dengan melewati leher ke depan dan belakang melalui api Bunsen panas.
6. Pasang tutup pada botol / kapas pasang menggunakan jari kelingking. (Putar botol, tidak tutup.)
petunjuk Label tabung dan botol dalam posisi yang tidak akan terkikis selama penanganan. Entah spidol atau perekat diri label yang cocok. Kadang kapas plugs sengaja terbakar. Memadamkan api dengan segera menutupi dengan kering kain, bukan dengan meniup atau berendam dalam air. Inokulasi media dalam botol tutup dan tabung biasanya dilakukan oleh lingkaran.

Streak plate.
Loop digunakan untuk mempersiapkan streak plate . Ini melibatkan pengenceran progresif inokulum bakteri atau ragi di atas permukaan media agar dipadatkan dalam cawan Petri sedemikian rupa bahwa koloni tumbuh dengan baik dipisahkan darisatu sama lain.
Tujuan dari prosedur ini adalah untuk mendapatkan koloni murni tunggal yang terisolasi.
1 . Kendurkan bagian atas botol berisi inokulum.
2 . Pegang lingkaran di tangan kanan.
3 . Api loop dan biarkan dingin.
4 . Angkat botol / tabung reaksi yang berisi inokulum dengan tangan kiri.
5 . Lepaskan tutup / kapas steker dari botol / tabung reaksi dengan jari kelingking tangan kiri.
6 . Flame leher botol / tabung reaksi.
7 . Masukkan loop ke dalam kaldu kultur dan menarik.
Pada setiap waktu , terus loop sebagai masih mungkin.
8 . Api leher botol / tabung reaksi.
9 . Ganti tutup / kapas steker pada botol / tabung reaksi menggunakan jari kelingking . Tempat botol / tabung uji pada bangku.
10 . Sebagian mengangkat tutup cawan Petri yang berisi media padat.
11 . Pegang dibebankan lingkaran paralel dengan permukaan agar-agar , smear inokulum belakang dan ke depan di area kecil menengah (lihat diagram 1 melesat luas = A ).
12 . Hapus loop dan menutup cawan Petri.
13 . Api loop dan biarkan dingin . Memutar piringan melalui 90 º berlawanan arah jarum jam.
14 . Dengan didinginkan lingkaran beruntun piring dari daerah A di seluruh permukaan agar-agar dalam tiga garis paralel ( ke B lihat diagram 2 ). Pastikan bahwa sejumlah kecil kultur dibawa.
15 . Hapus loop dan menutup cawan Petri .
16 . Api loop dan biarkan dingin . Memutar piringan melalui 90 º berlawanan arah jarum jam lagi dan beruntun dari B di permukaan agar-agar dalam tiga garis paralel ( ke C see diagram 3 ).
17 . Hapus loop dan menutup cawan Petri.
18 . Api loop dan biarkan dingin . Memutar piringan melalui 90 º lingkaran berlawanan arah jarum jam dan beruntun di permukaan agar-agar dari C ke pusat piring ( untuk D lihat diagram 3 ).
19 . Hapus loop dan menutup cawan Petri . Api loop.
20 . Seal dan menetaskan piring dalam posisi terbalik .petunjuk Label setengah dari piring yang berisi media , penggunaan singkatan dan menjaga mereka ke tepi piring agar tidak mengganggu pengamatan kemudian koloni . Hal yang sama berlaku untuk menuangkan dan piring penyebaran dijelaskan di bawah ini . Entah spidol atau label perekat diri yang cocok .

Ada dua pendekatan untuk membuat streak plate : ( 1 ) dengan dasar ( berisi media ) ditempatkan pada permukaan kerja , mengangkat tutup vertikal (yaitu masih menutupi dasar ) paling sedikit yang akan memungkinkan akses dari loop , (2 ) dengan tutup ditempatkan pada permukaan kerja , angkat dasar , invert dan menyuntik ke atas - menghadap permukaan agar-agar . Metode kedua adalah terbaik disediakan untuk siswa yang lebih tua bekerja di debu dan draft- bebas laboratorium yang relatif , itu adalah salah satu yang digunakan oleh profesional mikrobiologi .
Inokulasi cair nutrisi botol agar didinginkan.
1 . Angkat cair nutrisi botol agar didinginkan.
2 . Lepaskan tutup dari botol agar nutrisi cair dengan jari kelingking tangan kanan yang masih memegang bermuatan pipet . Jangan meletakkan tutupnya.
3 . Flame leher botol.
4 . Masukkan pipet ke dalam botol dan dengan lembut melepaskan jumlah yang diperlukan tetes inokulum keagar. 5 . Flame leher botol dan mengganti tutupnya.
6 . Masukan pipet ke dalam panci buang. Hapus dot sementara pipet menunjuk ke disinfektan.

Teknik tuang / pour plate 1 . Gulung botol lembut antara tangan untuk mencampur kultur dan menengah secara menyeluruh . Hindari membuat udara gelembung.
2 . Pegang botol di tangan kiri , melepas tutup dengan jari kelingking tangan kanan.
3 . Flame leher botol.
4 . Angkat tutup cawan Petri sedikit dengan tangan kanan dan tuangkan campuran ke dalam cawan Petri dan mengganti tutupnya.
5 . Flame leher botol dan mengganti tutupnya.
6 . Lembut memutar piring untuk memastikan bahwa media mencakup piring merata.
7 . Biarkan piring untuk memperkuat.
8 . Seal dan menetaskan piring dalam posisi terbalik . ( Dasar piring harus ditutupi , agar tidak harus menyentuh tutup piring dan permukaan harus halus tanpa gelembung ).

Menuangkan media diinokulasi
petunjuk
Jika pipet tidak tersedia maka loop kawat dapat digunakan. Beberapa loopfuls kultur harus ditambahkan ke didinginkan agar nutrisi cair untuk memastikan bahwa ada cukup inokulum hadir untuk pertumbuhan.

Menggunakan sebuah spreader
Penyebar steril digunakan untuk mendistribusikan inokulum atas permukaan sudah menyiapkan pelat agar . petunjuk
Dianjurkan untuk menggunakan piring agar-agar yang memiliki permukaan sumur kering sehingga mengering inokulum cepat. keringkan permukaan pelat agar dengan baik menginkubasi piring selama beberapa jam , misalnya semalam, sebelumnya atau meletakkan mereka dalam oven udara panas ( ca 55-60 º C ) selama 30-60 menit dengan dua bagian terpisah dan permukaan bagian diarahkan ke bawah.
Penyebar kaca dibungkus dapat disterilisasi dalam oven udara panas (lihat " Media , Sterilisasi dan Desinfektan) . Mereka juga dapat disterilkan dengan menyala dengan alkohol.
Sterilisasi menggunakan alkohol
1 . Celupkan ujung bawah spreader ke dalam volume kecil 70 % alkohol yang terkandung dalam bejana dengan tutup (baik topi sekrup atau aluminium foil ).
2 . Berlalu dengan cepat melalui burner api Bunsen untuk menyalakan alkohol , alkohol akan membakar dan mensterilkan kaca.
3 . Hapus spreader dari nyala api dan biarkan alkohol untuk membakar.
4 . Jangan menaruh spreader di bangku.

petunjuk
Pastikan bahwa penyebar yang mengarah ke bawah padahal dan setelah memicu alkohol untuk menghindari pembakaran sendiri. Jauhkan gelas alkohol jauh dari api Bunsen.
penyebaran pelat
Penyebaran piring , juga dikenal sebagai piring rumput , harus menghasilkan kultur merata di atas permukaan pertumbuhan media . Ini berarti bahwa mereka dapat digunakan untuk menguji sensitivitas bakteri terhadap banyak zat antimikroba , untuk Contoh obat kumur , bawang putih , desinfektan dan antibiotik . Penyebaran plat dapat digunakan untuk pekerjaan kuantitatif ( jumlah koloni ) jika inokulum adalah volume terukur , biasanya 0,1 cm3 , dari masing-masing seri pengenceran , disampaikan oleh pipet.
1 . Longgarkan tutup botol yang mengandung kultur kaldu.
2 . Pegang pipet steril di tangan kanan dan botol / tabung reaksi yang berisi kultur kaldu di sebelah kiri.
3 . Lepaskan tutup / pasang dari botol / tabung reaksi dengan jari kelingking tangan kanan dan api leher.
4 . Dengan pipet , menghapus sejumlah kecil kaldu.
5 . Flame leher botol / tabung reaksi dan mengganti tutup / pasang.
6 . Dengan tangan kiri , sebagian mengangkat tutup cawan Petri yang berisi media nutrisi padat.
7 . Tempatkan beberapa tetes kultur ke permukaan sekitar 0,1 cm3 ( ca 5 tetes , cukup untuk menutupi sepotong 5 sen ).
8 . Ganti tutup cawan Petri.
9 . Tempatkan pipet dalam stoples buang.
10 . Celupkan penyebar kaca menjadi alkohol , api dan biarkan alkohol untuk membakar.
11 . Angkat tutup cawan Petri untuk memungkinkan masuknya penyebar.
12 . Tempatkan penyebar pada permukaan agar diinokulasi dan memutar piringan dengan tangan kiri memindahkan spreader di atas-ke- bawah atau gerakan sisi ke sisi untuk menyebarkan inokulum atas permukaan agar-agar. Pastikan seluruh permukaan agar-agar tertutup. Operasi ini harus dilakukan dengan cepat untuk meminimalkan resiko kontaminasi.
13 . Ganti tutup cawan Petri.
14 . Api penyebar menggunakan alkohol.
15 . Biarkan inokulum kering.
16 . Seal dan menetaskan piring dalam posisi terbalik.

petunjuk
Pertimbangkan drop dikalibrasi ( Miles dan Misra ) metode untuk menghitung koloni kultur murni bakteri danragi sebagai metode yang lebih ekonomis daripada pour plate dan pelat menyebar . Prosedurnya adalah sebagai untuk menyebarkan piring piring tapi sedikit diperlukan karena : ( 1 ) inokulum disampaikan sebagai tetes dari pipet menjatuhkan yang dikalibrasi (dengan diameter luar ujung) untuk memberikan tetes volume diukur misalnya 0,02 cm ³ , (2 ) banyak tetes ( enam atau lebih ) dapat diletakkan di satu piring . Metode ini tidak cocok untuk digunakan dengan kultur yang menghasilkan menyebarkan pertumbuhan termasuk kultur campuran dalam banyak sampel alam seperti tanah meskipun yoghurt dan keju adalah salah satu pengecualian .

Metode Pemeriksaan Mould & Yeast (kapang & kamir)

Metode Pemeriksaan Mould & Yeast (kapang & kamir) ini merupakan metode yang merujuk pada ISO ISO 21527-1.
Peralatan:
1. Autoclave
2. Inkubator
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm
4. Pipet dengan kapasitas 1 ml
5. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 44 0C- 47 0C
6. Mikroskop
7. Tabung atau botol
8. Kaca pembesar (pembesaran 6,5 hingga 50 kali)
9. Penyebar terbuat dari kaca atau plastic (berdiameter 2 mm dan panjang 80 mm)
10. Timbangan
11. Burnsen atau pembakar Spiritus
12. Sendok steril

Bahan/ media:
1. Maximum recovery diluents
2. Dichloran-rose Bengal chloramphenicol agar (DRBC)

Langkah Kerja:
1. Campurkan 180 ml diluents dengan 20 gram sampel yang akan diuji ke dalam plastic steril, lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10-2).
2. Pindahkan 0,1 ml dari suspensi awal (pengenceran 10-1) pada cawan petri berisi DRBC agar. Pindahkan 1 ml pengenceran 10-2 dengan pipet steril lainnya pada cawan petri lain berisi DRBC agar.
3. Sebarkan cairan di atas permukaan cawan petri dengan penyebar steril sampai cairan sepenuhnya diserap ke dalam medium.
4. Inkubasi cawan petri secara aerobik dengan tutup menonjol, dalam posisi tegak dalam inkubator pada suhu 25°C ± 1°C selama 5 hari. Sebaiknya inkubasikan cawan pteri pada plastic terbuka agar incubator tidak terkontaminasi jamur yang tumbuh dalam cawan petri.
Hitung cawan petri antara hari ke-2 dan hari ke-5 dari masa inkubasi. Pilih cawan petri yang mengandung kurang dari 150 koloni/ propagul/ kuman dan hitung koloni-koloni/ propagul/ kuman. Jika jamur tumbuh dengan cepat, hitung koloni/ propagul/ kuman setelah 2 hari dan setelah 5 hari inkubasi. Jika perlu, melakukan pemeriksaan dengan kaca pembesar atau dengan mikroskop untuk membedakan antara sel ragi atau jamur dan bakteri dari koloni.
5. Setelah selesai melakukan penghitungan dan pencatatan koloni, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121oC selama 15 menit.

Pemeriksaan Enterobacteriaceace

Metode analisa enterobacteriaceae ini merupakan metode yang merujuk pada ISO 21528-2.

Peralatan:
1. Autoclave.
2. Inkubator.
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm.
4. Loops berdiameter ± 3 mm, kawat dari bahan krom atau bahan steril lain yang dapat dibuang.
5. Pipet dengan kapasitas 1 ml.
6. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 44°C- 47°C.
7. Tabung atau botol dengan kapasitas maksimal 500 ml.
8. Stomacher
9. Spiritus.
10. Timbangan.

Bahan/ media:
1. Maximum recovery diluents.
2. Violet red bile glucose (VRBG) agar.
3. Nutrient Agar.
4. Glucose Agar.
5. Oxidase Reagent.

Carakerja:
1. Campurkan 180 ml diluents dengan 20 gram sampel yang akan diuji ke dalam plastic steril, lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10^-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10^-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10^-1) dengan pipet steril ke dalam cawan. Ambil cawan petri steril lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10^-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Tuangkan sekitar 10 ml Violet red bile glucose (VRBG) agar (44°C hingga 47°C) ke dalam setiap cawan petri. Lama waktu antara inokulasi dan saat ketika media dituangkan ke cawan petri tidak akan boleh melebihi 15 menit. Campurkan inokulum dengan media dengan memutar cawan Petri secara hati-hati dan biarkan campuran memadat dengan meninggalkan cawan Petri berdiri pada permukaan horizontal dingin.
4. Setelah pemadatan sempurna, tambahkan 15 ml Violet red bile glucose (VRBG) agar, kemudian didinginkan. Balikkan cawan petri dan simpan dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam ± 2 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Indentifikasi karakteristik koloni yang berwarna pink ke merah atau ungu (dengan atau tanpa presipitasi halo). Pilih cawan petri yang mengandung kurang dari 150 koloni karakteristik, hitung koloni ini. Kemudian pilih secara acak lima koloni tersebut untuk subkultur untuk tes konfirmasi biokimia. Enterobacteriaceae tertentu dapat menyebabkan penghilangan warna koloni mereka atau medium. Apabila tidak ada koloni karakteristik yang hadir, pilih lima koloni putih untuk konfirmasi.
6. Subkultur koloni pilihan dengan menggores media nutrient agar dengan koloni yang dipilih untuk konfirmasi. Inkubasi kultur pada suhu 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
7. Konfirmasi biokimia:
a). Uji reagen oksidase
Ambil sebagian koloni kultur pada media nutrient agar dengan menggunakan loop atau kawat, gunakan oksidase kit. Hasil uji negatif ketika warna kertas filter tidak berubah menjadi gelap dalam 10 detik.
b). Uji fermentasi
Ambil koloni koloni kultur pada media nutrient agar yang sama dengan yang digunakan untuk uji reagen oksidase, inokulasikan pada tabung berisi glucose agar. Inkubasi dalam incubator pada 37°C selama 24 jam ± 2 jam. Jika terjadi perubahan warna kuning ke seluruh isi tabung, maka reaksidianggap positif.
8. Interprestasi uji biokimia.
Koloni yang menunjukkan negatif pada reaksi reagen oksidase dan positif pada reaksi glikosa dianggap sebagai Enterobactericeae.
9. Setelah selesai melakukan konfirmasi, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121°C selama 15 menit.