Pemeriksaan Enterobacteriaceace

Metode analisa enterobacteriaceae ini merupakan metode yang merujuk pada ISO 21528-2.

Peralatan:
1. Autoclave.
2. Inkubator.
3. Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm.
4. Loops berdiameter ± 3 mm, kawat dari bahan krom atau bahan steril lain yang dapat dibuang.
5. Pipet dengan kapasitas 1 ml.
6. Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 44°C- 47°C.
7. Tabung atau botol dengan kapasitas maksimal 500 ml.
8. Stomacher
9. Spiritus.
10. Timbangan.

Bahan/ media:
1. Maximum recovery diluents.
2. Violet red bile glucose (VRBG) agar.
3. Nutrient Agar.
4. Glucose Agar.
5. Oxidase Reagent.

Carakerja:
1. Campurkan 180 ml diluents dengan 20 gram sampel yang akan diuji ke dalam plastic steril, lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10^-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10^-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10^-1) dengan pipet steril ke dalam cawan. Ambil cawan petri steril lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10^-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Tuangkan sekitar 10 ml Violet red bile glucose (VRBG) agar (44°C hingga 47°C) ke dalam setiap cawan petri. Lama waktu antara inokulasi dan saat ketika media dituangkan ke cawan petri tidak akan boleh melebihi 15 menit. Campurkan inokulum dengan media dengan memutar cawan Petri secara hati-hati dan biarkan campuran memadat dengan meninggalkan cawan Petri berdiri pada permukaan horizontal dingin.
4. Setelah pemadatan sempurna, tambahkan 15 ml Violet red bile glucose (VRBG) agar, kemudian didinginkan. Balikkan cawan petri dan simpan dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24 jam ± 2 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
5. Indentifikasi karakteristik koloni yang berwarna pink ke merah atau ungu (dengan atau tanpa presipitasi halo). Pilih cawan petri yang mengandung kurang dari 150 koloni karakteristik, hitung koloni ini. Kemudian pilih secara acak lima koloni tersebut untuk subkultur untuk tes konfirmasi biokimia. Enterobacteriaceae tertentu dapat menyebabkan penghilangan warna koloni mereka atau medium. Apabila tidak ada koloni karakteristik yang hadir, pilih lima koloni putih untuk konfirmasi.
6. Subkultur koloni pilihan dengan menggores media nutrient agar dengan koloni yang dipilih untuk konfirmasi. Inkubasi kultur pada suhu 37°C selama 24 jam ± 2 jam.
7. Konfirmasi biokimia:
a). Uji reagen oksidase
Ambil sebagian koloni kultur pada media nutrient agar dengan menggunakan loop atau kawat, gunakan oksidase kit. Hasil uji negatif ketika warna kertas filter tidak berubah menjadi gelap dalam 10 detik.
b). Uji fermentasi
Ambil koloni koloni kultur pada media nutrient agar yang sama dengan yang digunakan untuk uji reagen oksidase, inokulasikan pada tabung berisi glucose agar. Inkubasi dalam incubator pada 37°C selama 24 jam ± 2 jam. Jika terjadi perubahan warna kuning ke seluruh isi tabung, maka reaksidianggap positif.
8. Interprestasi uji biokimia.
Koloni yang menunjukkan negatif pada reaksi reagen oksidase dan positif pada reaksi glikosa dianggap sebagai Enterobactericeae.
9. Setelah selesai melakukan konfirmasi, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121°C selama 15 menit.

Metode analisa TPC

Metode alisa TPC (total plate count) ini merupakan merupakan metode analisa mikrobiologi pengembanyan atau in house method  yang merujuk pada metode ISO 4833.Gunakan Alat Pelindung Diri (APD) yang sesuai pada saat melakukan pekerjaan.

Peralatan:
1.Autoclave
2.Inkubator
3.Cawan petri terbuat dari gelas atau plastic dengan diameter 90 mm
4.Pipet dengan kapasitas 1 ml
5.Water bath yang dapat beroperasi pada suhu 44 0C- 47 0C
6.Timbangan
7.Sendok steril
8.Tabung atau botol dengan kapasitas maksimal 500 ml
9.Plastik steril
10.Stomacher
11.Spiritus

Bahan/ media:
1.Maximum recovery diluents
2.Media Plate Count Agar

Carakerja Metode Analisa TPC

1. Campurkan 180 ml diluents dengan 20 gram sampel yang akan diuji ke dalam plastic steril, lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspensi dari pengenceran sebelumnya masukkan ke dalam tabung, campurkan ke dalamnya diluents sebanyak 9 ml, kocok hingga merata (pengenceran 10-2).
2. Ambil dua cawan petri steril. Pindahkan 1 ml (pengenceran 10-1) dengan pipet steril ke dalam cawan. Ambil cawan petri steril lainnya. Pindahkan 1 ml pengenceran 10-2 dengan pipet steril lainnya.
3. Tuangkan sekitar 12 ml sampai 15 ml Plate Count Agar (44°C-47°C) ke dalam setiap cawan petri. Lama waktu antara akhir pembuatan suspensi awal (atau pengenceran 10-1 jika produk cair) dan saat ketika media dituangkan ke cawan petri tidak akan boleh melebihi 45 menit. Campurkan inokulum dengan media dengan memutar cawan Petri secara hati-hati dan biarkan campuran memadat dengan meninggalkan cawan Petri berdiri pada permukaan horizontal dingin.
4. Setelah pemadatan berakhir, apabila dicurigai bahwa produk yang diperiksa mengandung mikroorganisme dengan koloni yang akan banyak tumbuh di permukaan medium, tuangkan 4 ml overlay medium (44°C-47°C) ke atas permukaan media yang telah diinokulasi. Biarkan memadat.
5. Balikan cawan petri dan tempatkan dalam inkubator pada 30 ° C ± 1 ° C selama 72 jam ± 3 jam. Jangan menumpuk cawan petri lebih dari enam cawan. Tumpukan cawan petri harus dipisahkan dari satu sama lain dan dari dinding dan atas inkubator.
6. Setelah masa inkubasi yang ditentukan, hitung banyaknya koloni pada cawan petri menggunakan peralatan colony counting, jika diperlukan. Periksa cawan petri di bawah cahaya terang. Pinpoint koloni harus dimasukkan dalam hitungan. Dalam proses perhitungan, analis harus menghindari kekeliruan menghitung partikel materi tidak larut atau mengendap di cawan petri sebagai koloni pinpoint. Periksalah benda meragukan dengan hati-hati, dengan menggunakan perbesaran yang lebih tinggi untuk membedakan koloni dari benda asing.
7. Perhitungan koloni yang menyebar dianggap sebagai koloni tunggal. Jika kurang dari seperempat dari cawan petri ditumbuhi oleh koloni yang menyebar, hitung koloni pada bagian yang tidak terpengaruh dari cawan petri dan hitung jumlah yang sesuai dari seluruh cawan petri. Jika lebih dari seperempat yang ditumbuhi oleh koloni menyebar, buang perhitungan. Jumlah maksimum total koloni untuk dihitung sebanyak 300 koloni per cawan petri.
8. Contoh cara perhitungan:
Banyaknya koloni pada cawan petri dengan pengenceran 10^1 = 168 koloni
Banyaknya koloni pada cawan petri dengan pengenceran 10^2 = 14 koloni

Masukan data hasil perhitungan ke dalam rumus N = ΣC/(V×1,1×d)

ΣC = jumlah koloni yang dihitung pada 2 cawan petri, dengan jumlah minimum per cawan 10 koloni
V = volume inokulum yang dimasukan ke dalam setiap cawan petri
D = pengenceran pertama yang dilakukan

Sehingga N= (168+14)/(1x1.1x10^-1) = 182/0.11 = 1684

Lakukan pembulatan ke atas sehingga jumlah mikroorganisme dalam produk adalah 1700 per milliliter/ per gram.
9. Setelah selesai melakukan penghitungan dan pencatatan koloni, limbah sisa dikumpulkan di satu kantung plastik dan disterilkan di dalam autoclave 121oC selama 15 menit.

Catatan:
1. Lakukan pengecekan kembali dengan melakukan uji ulang. Apabila dalam melakukan pengujian ulang perbedaan absolut antara dua hasil uji independen tunggal, yang diperoleh dengan menggunakan metode yang sama pada materi tes yang identik di laboratorium yang sama oleh operator yang sama menggunakan peralatan yang sama dalam interval waktu yang singkat, tidak boleh lebih besar dari batas pengulangan, r = 0 , 25, di log10 mikroorganisme per mililiter (sesuai dengan 1,8 pada skala normal dalam mikroorganisme per mililiter).
2. Apabila melakukan pengecekan ulang sampel dengan bantuan laboratorium lain. Perbedaan absolut antara dua hasil tes tunggal, diperoleh dengan menggunakan metode yang sama pada materi uji identik dalam laboratorium yang berbeda dengan operator yang berbeda menggunakan peralatan yang berbeda, tidak boleh lebih besar dari batas reproduktifitas, R = 0,45, di log10 mikroorganisme per mililiter (sesuai ke 2,8 pada skala normal dalam mikroorganisme per mililiter).

Sterilisasi dan Desinfeksi

Sterilisasi dan Desinfeksi yang Umum Dilakukan di Lab Mikrobiologi

Pengertian sterilisasi dan desinfeksi
Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan menghancuran atau memusnahkan semua mikro-organisme termasuk spora, dari sebuah benda atau lingkungan. Hal ini biasanya dilakukan dengan pemanasan atau penyaringan tetapi bahan kimia atau radiasi juga dapat digunakan.
Disinfeksi adalah perusakan, penghambatan atau penghapusan mikroba yang dapat menyebabkan penyakit atau masalah lain misalnya seperti pembusukan. Hal ini biasanya dicapai dengan menggunakan bahan kimia.

Macam-macam sterilisasi

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi.

1. Sterilisai secara mekanik (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) yaitu teknik sterilisasi dengan menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22mikron atau 0.45 mikrob) Cairan yang akan disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang mudah rusak jika terkena panas, atau mudah menguap (volatile) dan bahan yang tidak tahan panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini.

Sterilisasi dengan penyaringan dapat dilakukan dengan berbagai cara antaralain:

a). Non-disposable filtration apparatus

- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 20-1000 ml










b). Disposable filter cup unit

- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml







c). Disposable filtration unit dengan botol penyimpan

- Disedot dengan pompa vakum
- Volume 15-1000 ml











d). Syringe filters

- Ditekan seperti jarum suntik
- Volume 1-20 ml











e). Spin filters

- Ditekan dengan gaya setrifugasi
- Volume kurang dari 1 ml

2. Sterilisasi secara fisik dengan pemanasan & penyinaran.

2.1. Sterilisasi dengan pemanasan
a). Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b). Panas kering: sterilisasi dengan oven suhu 180 oC selama 1 jam. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi dll.

c). Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. Misalnya susu yang disterilkan dengan suhu tinggi akan mengalami koagulasi dan bahan yang berpati disterilkan pada suhu bertekanan pada kondisi pH asam akan terhidrolisis.

d. Uap air panas bertekanan : menggunalkan autoklaf
autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121 oC. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu  121 oCdan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 121oC atau 249,8 oF adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 100oC, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121oC dan tekanan 15 psi selama 15 menit.

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timermulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.

Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :
- Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim.
- Paelarut organik, seperti fenol.
- Buffer dengan kandungan detergen, seperti SDS

Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :
- Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat.
- Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain.
- Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar.
- Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf.
- Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0.

Sanagt penting bagi kita untuk memverifikasi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna. Umumnya beberapa cara untuk memastikan atau memverifikasi autoklaf bekerja dengan baik, diantaranya antaralain:

1).Indicator tape for sterilization

yaitu tape (isolasi) yang mengandung bahan kimia tertentu yang akan berubah warna apabila dilakukan sterilisasi dan hanya digunakan untuk satu kali pemakaian. Cara penggunannya sangat mudah cukup menempelkan tape indicator pada Erlenmeyer atau botol yang berisi media atau bahan yang akan disterilkan di autoklaf, setelah proses sterilisasi selesai jika autoklaf yang kita gunakan bekerja dengan baik maka tape tersebut akan berubah warna dan sebaliknya jika sterilisasi tidak berjalan dengan baik maka tape tidak akan berubah warna.

2). Sterikon bioindikator

yaitu indikator serilisasi yang menggunakan bakteri/mikroba bersifat termofilik sebagai penguji sterilisasi, yang ditempatkan dalam ampul . mikroba yang digunakan biasanya Bacillus stearothermophillus(bakteri yang optimal hidup pada suhu 60oC). prinsipnya jika sterilisasi berjalan dengan baik maka bakteri pada bioindikator akan mati, tetapi jika tidak bakteri akan tetap hidup dan akan terjadi perubahan warna pada bioindikator. cara penggunanya cukup masukan ampul sterikon bioindikator kedalam autoklaf yang akan kita verifikasi kemudaian setelah proses sterilisasi selesai inkubasi bioindikator tersebuk pada suhu 60oC selama 24 jam kemudian amati jika tidak terjadi perubahan warna artinaya autoklaf bekerja dengan baik atau steril, namun jika terjadi perubahan warna menjadi kuning berarti autoklaf tidak bekerja dengan baik atau sterilisasi tidak tercapai.