Metode Deteksi dan Perhitungan Coliform dengan teknik MPN

Berikut adalah metode dan perhitungan coliform dengan teknik MPN berdasarkan ISO 4831

Peralatan:
1. Autoclave
2. Inkubator
3. Pipet dengan kapasitas 1 ml
4. pH meter
5. Tabung dengan dimensi 16 mm x 160 mm
6. Tabung durham
7. Loop
8. Timbangan
9. Sendok steril

Bahan/ media:
1. Buffered peptone water (BPW)
2. Lauryl sulfate trptpse broth (single strength medium)
3. Lauryl sulfate trptpse broth (double strength medium)
4. Brilliant green lactose broth

Pembuatan media:
1. Campurkan Buffered Peptone Water sebanyak 20 gram dengan 1 liter air distilasi. Aduk hingga merata. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya.
2. Campurkan 36,5 gram Lauryl sulfate trptpse broth dengan 1 liter air distilasi. Tuang media sebanyak 10 ml ke dalam tabung yang berisi tabung durham. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya. Tabung durham tidak boleh berisi gelembung setelah sterilisasi.
3. Campurkan 73 gram Lauryl sulfate trptpse broth dengan 1 liter air distilasi. Tuang media ke dalam tabung. Sterilkan diluents di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya.
4. Campurkan 40 gram Briliant green lactose broth dengan 1 liter air distilasi. Aduk merata, tuang media sebanyak 10 ml ke dalam tabung berisi tabung durham. Sterilkan media di dalam autoclave 121oC selama 15 menit. Tunggu hingga suhu autoclave turun hingga 80oC untuk dapat membukanya. Tabung durham tidak boleh berisi gelembung setelah sterilisasi.


Langkah kerja:

Metode deteksi:
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik.
2. Pindahkan 10 ml suspense ke dalam tabung berisi double strength medium, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam.
3. Pindahkan 1 ml suspense ke dalam tabung berisi single strength medium, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam. Apabila setelah 24 jam ± 2 jam, belum muncul reaksi pembentukan gas/ kekeruhan, inkubasikan kembali selama 24 jam ± 2 jam.
4. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media double strength dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
5. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media single strength yang menunjukkan pembentukan gas dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
6. Setelah masa inkubasi, interpretasikan tabung yang mengalami pembentukan gas sebagai tabung yang positif.

Metode perhitungan
1. Campurkan 225 ml BPW dengan 25 gram sampel uji di plastic steril. Lakukan homogenisasi dengan stomacher selama minimal 30 detik (pengenceran 10-1). Ambil 1 ml suspense pengenceran 10-1, masukkan ke dalam tabung berisi 9 ml BPW (pengenceran 10-2), kocok hingga merata. Ambil 1 ml suspense pengenceran 10-2, masukkan ke dalam tabung berisi 9 ml BPW (pengenceran 10-3), kocok hingga merata.
2. Pindahkan 10 ml suspense (pengenceran 10-1) ke dalam 3 tabung berisi double strength medium. Pindahkan masing-masing pengenceran sebanyak 1 ml ke dalam 3 tabung berisi single strength medium. Inkubasi 3 tabung pertama pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam, dan 9 tabung berikutnya, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam ± 2 jam. Apabila setelah 24 jam ± 2 jam, belum muncul reaksi pembentukan gas/ kekeruhan, inkubasikan kembali selama 24 jam ± 2 jam.
3. Setelah masa inkubasi, ambil kultur pada media double strength dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth, inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
4. Setelah masa inkubasi, lakukan konfirmasi dengan mengambil kultur pada media single strength setiap pengenceran yang menunjukkan pembentukan gas/ kekeruhan dengan menggunakan loop, inokulasikan kultur pada media Brilliant green lactose broth inkubasi pada suhu 30oC/ 37 oC selama 24 jam-48 jam.
5. Pada semua tabung uji setiap pengenceran, hitung jumlah tabung yang menunjukkan reaksi positif (pembentukan gas).